UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS RENATO FERREIRA DE ALMEIDA JUNIOR AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIVIRAL DO EXTRATO BRUTO DA PLANTA CAESALPINIA ECHINATA E DA RIFAMPICINA CONTRA O VÍRUS DENGUE-2 EM CULTURA DE CÉLULAS Natal Março/ 2015 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIVIRAL DO EXTRATO BRUTO DA PLANTA CAESALPINIA ECHINATAE DA RIFAMPICINA CONTRA O VÍRUS DENGUE-2 EM CULTURA DE CÉLULAS Dissertação de Mestrado Apresentada à Coordenação da Pós Graduação de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como Requisito para a obtenção do Título Mestre em Ciências Biológicas. Orientador: Dr.Kleber Juvenal Silva Farias Co-orientador: Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo Natal Março/2015 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL CURSO DE BIOMEDICINA AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIVIRAL DO EXTRATO BRUTO DA PLANTA CAESALPINIA ECHINATAE DA RIFAMPICINA CONTRA O VÍRUS DENGUE-2 EM CULTURA DE CÉLULAS elaborada por Renato Ferreira de Almeida Junior e aprovada por todos os membros da Banca examinadora como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. Natal, 16 de Março de 2015 BANCA EXAMINADORA _____________________________________________ Prof. Dr José Veríssimo Fernandes (Departamento de Microbiologia e Parasitologia) _________________________________________ Prof. Dr. Francisco Fabio Marques da Silva. (Universidade Federal de Campina Grande) _________________________________________ Profª. Drª. Vânia Sousa Andrade (Departamento de microbiologia e parasitologia) Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências Almeida Júnior, Renato Ferreira. Avaliação do potencial antiviral do extrato bruto da planta Caesalpinia Echinata e da rifampicina contra vírus dengue-2 em cultura de células / Renato Ferreira Almeida Júnior. – Natal, RN, 2015. 70 f.: il. Orientador: Dr. Kleber Juvenal Silva Farias. Coorientador: Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. 1. Vírus dengue-2. – Dissertação. 2. Caesalpinia echinata. – Dissertação. 3. Rifampicina. – Dissertação. I. Farias, Kleber Juvenal Silva. II. Araújo, Josélio Maria Galvão de. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSE-CB CDU 614.4 Dedico este trabalho aos meus pais Renato e Claudia, meu irmão Ruan, toda minha família e minha Noiva Marlyanne Agradecimentos Aos meus pais por toda dedicação e paciência que sempre tiveram comigo; Ao meu professor, orientador e amigo Dr. Kleber Farias pela confiança depositada em mim, e por sempre me guiar em minhas duvidas; Ao meu também orientador Professor Josélio Galvão por sempre estar presente em qualquer dificuldade; Aos colegas de laboratório, Tábata, Yasmin e Fabiana pela colaboração nos experimentos; A todos os colegas do Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Infeciosas e do Câncer pela contribuição que sempre dispuseram para a realização de todos os ensaios que realizamos; A todos os professores que deram aula no curso da pós-graduação, pela dedicação e os ensinamentos transmitidos a nós; A todos os colegas de turma; A todos os funcionários do departamento de Microbiologia e Parasitologia do Centro de Biociências; Aos funcionários do Instituto de Medicina Tropical; Aos meus familiares que sempre me deram apoio e incentivo; Aos professores participantes da banca examinadora, A minha noiva Marlyanne por sempre estar ao meu lado, me dando apoio, incentivo e tendo muita paciênciaao longo desses cinco anos e meio. A todos aqueles que direta ou indiretamente colaboraram para que este trabalho fosse realizado. RESUMO Os vírus dengue pertence à família Flaviviridae e ao gênero Flavivirus, sendo composto por 4 sorotipos antigenicamente distintos, são considerados os arbovírus mais importantes no mundo por causar altas taxas de morbidade e mortalidade em regiões tropicais e subtropicais do planeta, colocando em risco até 3,6 bilhões de pessoas em mais de 100 países. Por ser uma doença com amplo espectro clínico e por não possuir vacina ou tratamento eficaz, o estudo de possíveis antivirais que visam diminuir a viremia do paciente é de suma importância, já que este é um dos fatores que pode levar a febre hemorrágica da dengue e a síndrome do choque da dengue que são as formas grave da doença. No presente estudo foi avaliado o potencial antiviral do extrato da folhada planta Caesalpinia echinata contra o vírus dengue-2 (DENV-2) em cultura de células C6/36 e Vero e a ação antiviral da Rifampicina em células Vero. A escolha da Caesalpinia echinata se deve ao fato de que já foi observada sua ação anti- inflamatória e antimalárica, além de não ter sido encontrado nenhum trabalho que tenha avaliado seu potencial de ação frente a vírus. A Rifampicina foi escolhida por demonstrado ação antiviral, principalmente contra os poxvirus, porém poucos sãos os relatos da utilização deste fármaco contra vírus de RNA. O resultado foi obtido através da quantificação da carga viral pela técnica da qRT-PCR em Tempo Real. As células infectadas por DENV-2 foram submetidas ao tratamento pelo período de 7 dias em diferentes concentrações do extrato da planta Caesalpinia echinataque variou entre 0,68 a 0,0068mg/mL. Não foi possível observar neste estudo, evidências de inibição significativa da replicação do vírus DENV-2 em ambas as culturas celulares. ARifampicina foi utilizada em diferentes condições de tratamento, no qual foi avaliado ao longo de 72 horas a carga viral produzida nas células Vero.Nas condições de tratamento pós-infecção e no ensaio virucida o fármaco apresentou atividade antiviral, reduzindo a taxa de replicação em 100 vezes em relação ao controle. De acordo com os nossos resultados conclui-se que a Rifampicina mostrou-se eficaz no combate a infecção do DENV-2 em cultura de células Vero. Palavras-chave: DENV-2, células C6/36 e Vero,Caesalpinia echinata, Rifampicina, quantificação, qRT-PCR em tempo real e PFU. ABSTRACT The dengue virus belongs to the Flaviviridae family and the Flavivirus genus, consisting of four serotypes antigenically distinct, are considered the most important arbovirus in the world to cause high rates of morbidity and mortality in tropical and subtropical regions of the world, threatening to 3, 6 billion people in over 100 countries. Because it is a disease with a wide clinical spectrum and has no vaccine or effective treatment, the study of possible antiviral drugs aimed at reducing viremia of patients is of paramount importance, since this is one of the factors which can lead to dengue hemorrhagic fever and dengue shock syndrome that are severe forms of the disease. In the present study we evaluated the antiviral potential of the leaf extract of the plant Caesalpinia echinata against dengue-2 virus (DENV-2) in cultured C6/36 and Vero cells and the antiviral action of Rifampicin on Vero cells. The choice of Caesalpinia echinata is due to the fact that has been observed its action anti-inflammatory and anti- malarial , and not have been found no study evaluated its antiviral effect. Rifampin was chosen was chosen for demonstrated antiviral action, especially against poxviruses, but few sane reports usage of this drug against RNA viruses. The result was obtained by quantifying the viral load bythe technique of Real-time qRT-PCR. Cells infected with DENV-2 were subjected to treatment for 7 days in different concentrations of plant extract Caesalpinia echinata (0.68 - 0,0068mg / ml). As a result, we could not observe a inhibition significant of virus replication in both cell cultures. The Rifampicin was used for different treatment condition,which were evaluated over 72 hours the amount of viral load produced in Vero cells, In the conditions treatment and the test virucidal theantiviral activity, which is capable of reducing the rate of 100X replication as compared to control. According to our results we can conclude that Rifampicin was effective in action against to infection DENV-2 in Vero cell culture. Keywords: DENV-2, C6/36 and Vero cell, Caesalpinia echinata, Rifampicin, quantification, Real-Time qRT-PCR, Caesalpinia echinata and PFU. LISTA DE ABREVIATURAS ADE Infecção mediada por anticorpo C Capsídeo CC Concentração citotóxica a 50% da monocamada celular 50 Cap Catabolite gene activator protein Depois de Cristo d.C Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3- DC-SING Grabbing Non-integrin DENV Vírus Dengue DENV-1, DENV-2, Vírus Dengue 1-4 DENV-3 e DENV-4 DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucleico DSS Síndrome do choque da dengue E Envelope FHD Febre Hemorrágica da dengue FITC Isotiocianato de fluoresceína HSV-1 e 2 Herpes Vírus Simplex tipo 1 e 2 IFI Imunofluorescência indireta IFN Interferon kDA Kilodaltons L-15 Meio de Cultura Leibovitz-15 M Membrana MIAF Mistura de fluido ascítico imune de camundongo MT Motifs metiltransferase MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide NS1 Proteína não estrutural 1 NS2 A e B Proteína não estrutural 2 Ns3 Proteína não estrutural 3 Ns4 A e B Proteína não estrutural 4 Ns5 Proteína não estrutural 5 ORF Open Reading frame PBS Tampão Fosfato-Salino PCR Reação em cadeia de Polimerase prM Pré-membrana PV-1 Póliovírus tipo 1 RNA Ácido ribonucleico SBF Soro Fetal Bovino