Universidade Federal do Rio Grande do Sul Faculdade de Medicina Programa de Pós-Graduação: Ciências em Gastroenterologia e Hepatologia Avaliação da erradicação do Helicobacter pylori na expressão de CD44v6 na metaplasia intestinal gástrica. Ronaldo João Spinato Torresini 2014 1 1 Universidade Federal do Rio Grande do Sul Faculdade de Medicina Programa de Pós-Graduação: Ciências em Gastroenterologia e Hepatologia Avaliação da erradicação do Helicobacter pylori na expressão de CD44v6 na metaplasia intestinal gástrica. Ronaldo João Spinato Torresini Orientador: Prof. Dr. João Carlos Prolla Co-orientador: Prof. Dr. Luiz Edmundo Mazzoleni Tese de Doutorado 2014 2 2 T693a Torresini, Ronaldo João Spinato Avaliação da erradicação do Helicobacter pylori na expressão da CD44v6 na metaplasia intestinal gástrica / Ronaldo João Spinato Torresini. - Porto Alegre: UFRGS, 2013. 55 p.: gráf. il. tab. Inclui um artigo científico submetido à publicação. Orientador: Prof. Dr. João Carlos Prolla. Coorientador: Prof. Dr. Luiz Edmundo Mazzoleni. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação: Ciências em Gastroenterologia e Hepatologia. Área de concentração: Gastroenterologia. 1. HELICOBACTER PYLORI. 2. NEOPLASIAS GÁSTRICAS/epidemiologia. 3. METAPLASIA. 4. LESÕES PRÉ- CANCEROSAS. 5. ESTÔMAGO. 6. MARCADORES BIOLÓGICOS DE TUMOR. 7. ANTÍGENOS CD44. 8. DISPEPSIA. 9. IMUNOISTOQUÍMICA. 10. HOSPITAIS UNIVERSITÁRIOS. 11. ENSAIOS CLÍNICOS CONTROLADOS ALEATÓRIOS. 12. MÉTODO DUPLO-CEGO. I. Prolla, João Carlos. II. Mazzoleni, Luiz Edmundo. III. Título. C.D.D. 617.63 N.L.M. QW 154 FICHA CATALOGRÁFICA T693a Torresini, Ronaldo João Spinato Avaliação da erradicação do Helicobacter pylori na expressão da CD44v6 na metaplasia intestinal gástrica / Ronaldo João Spinato Torresini. - Porto Alegre: UFRGS, 2014. 73 p.: gráf. il. tab. Inclui um artigo científico submetido à publicação. Orientador: Prof. Dr. João Carlos Prolla. Coorientador: Prof. Dr. Luiz Edmundo Mazzoleni. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação: Ciências em Gastroenterologia e Hepatologia. Área de concentração: Gastroenterologia. 2. HELICOBACTER PYLORI. 2. NEOPLASIAS GÁSTRICAS/epidemiologia. 3. METAPLASIA. 4. LESÕES PRÉ-CANCEROSAS. 5. ESTÔMAGO. 6. MARCADORES BIOLÓGICOS DE TUMOR. 7. ANTÍGENOS CD44. 8. DISPEPSIA. 9. IMUNOISTOQUÍMICA. 10. HOSPITAIS UNIVERSITÁRIOS. 11. ENSAIOS CLÍNICOS CONTROLADOS ALEATÓRIOS. 12. MÉTODO DUPLO-CEGO. I. Prolla, João Carlos. II. Mazzoleni, Luiz Edmundo. III. Título. C.D.D. 17.63 N.L.M. QW 154 Rosária Maria Lúcia Prenna Geremia Bibliotecária CRB 10/196 3 3 Dedico este trabalho à minha esposa Elizabeth e aos meu filhos Lourenço e Guilherme. 4 4 AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. João Carlos Prolla, mestre e amigo, sempre presente e cujos comentários e ensinamentos, tanto de ciência quanto de vida, são mensagens preciosas. Ao Prof. Dr. Luiz Edmundo Mazzoleni, colega e amigo, cujo dinamismo e entusiasmo levaram a cabo este grande projeto de pesquisa que é o HEROES, tendo eu a alegria de poder compartilhá-lo. Ao Prof. Dr. Carlos Fernando de Magalhães Francisconi e Dr. Guilherme Becker Sander, grande parceiros, e igualmente responsáveis pelo HEROES. À Profª. Dra Luise Meurer pela amizade e pela competência na análise das lâminas e disposição tranquila na realização desta tarefa. Ao Dr. Diego Uchoa pela competência e disponibilidade na leitura das lâminas. Aos Biomédicos Laura Renata De Bona e Tobias Cancian Milbrandt pelo empenho, dedicação e organização. Ao Prof. Dr. Vinicius Duval da Silva pela cooperação prestada a este trabalho. Ao Técnico em Patologia Tiago Giuliani pela competência e dedicação na feitura do material. Aos professores do PPG que aceitaram minha volta como estudante a esta Universidade e que me acolheram bem durante todo este período. À Sra. Moema Goulart e demais funcionárias do PPG. Ao serviço de Patologia Experimental onde as lâminas foram lidas e algumas refeitas. Ao Serviço de Gastroenterologia pela acolhida. Ao GPPG pelo apoio técnico e financeiro. Aos meus colegas do PPG que muito contribuíram nos Seminários de Pesquisa e no convívio. Aos Prof. comentaristas Profª. Dra Patricia Ashton-Prolla, ao Prof. Dr. Renato Fagundes e ao Prof. Dr. Vinicius Duval da Silva pela análise crítica do projeto de pesquisa e sugestões ao que se transformou nesta tese. Ao Prof. Daniel Simon da Ulbra que proporcionou estágios teóricos naquela Universidade e aos professores dos cursos que assisti. Aos pacientes que são a razão do nosso esforço. Aos meus pais, Moacyr (in memoriam) e Lori, agradeço por tantas coisas. 5 5 SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS _____________________________________________7 1.1 RESUMO _________________________________________________________ 9 1.2 ABSTRACT _____________________________________________________ 10 2 INTRODUÇÃO _____________________________________________________ 11 2.1 Aspectos Epidemiológicos do Câncer Gástrico ______________________________ 11 2.2 Metaplasia Intestinal Gástrica (MIG) _____________________________________ 12 2.3 CD44 ________________________________________________________________ 18 3 JUSTIFICATIVA ____________________________________________________ 22 4 OBJETIVOS ________________________________________________________ 23 4.1 Objetivo Principal _____________________________________________________ 23 4.2 Objetivos Específicos ___________________________________________________ 23 5 AMOSTRA E MÉTODO _____________________________________________ 24 5.1 Critérios de Inclusão ___________________________________________________ 25 5.2 Critérios de Exclusão___________________________________________________ 25 5.3 Procedimentos ________________________________________________________ 26 4.3.1 Teste para detecção CD44v6 por imunoistoquímica ______________________________ 26 4.3.2 Coloração das lâminas para estudo histopatológico ______________________________ 27 4.3.3 Análises estatísticas e tamanho da amostra _____________________________________ 28 5.4 Considerações Éticas ___________________________________________________ 29 6 RESULTADOS ______________________________________________________ 30 7 DISCUSSÃO ________________________________________________________ 38 8 CONCLUSÕES ______________________________________________________ 48 9 REFERÊNCIAS _____________________________________________________ 49 10 ANEXOS ___________________________________________________________ 59 ANEXO 1 - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO __________ 59 ANEXO 2- Trabalho apresentado na Semana Brasileira do Aparelho Digestivo, Florianópolis 2010, como apresentação oral ____________________________________ 61 ANEXO 3 - Artigo a ser enviado para publicação em revista especializada__________ 62 6 6 LISTA DE ABREVIATURAS AB Alcian blue CD44s Proteína CD44 (cluster of differentiation) padrão (standard) CD44v Variantes da proteína CD44 CDX2/CDX1 Regula a diferenciação da linhagem intestinal CEP Comissão de ética em pesquisa Ciclina D2 Regula o ciclo celular DAB Diaminobenzina DAP-quinase Death-associated protein kinase, proteína associada à morte celular, pró-apoptótica DNA Ácido desoxirribonucléico cDNA Ácido desoxirribonucléico complementar E-caderina Molécula de adesão celular EGFR Epidermal growth factor receptor, receptor do fator de crescimento epidérmico ERBB2 erythroblastic leukemia-associated viral oncogene B (ERBB) homologue 2, oncogene viral B associado a leukemia eritroblástia homólogo 2 GAM Gastrite Atrófica Multifocal GPPG Grupo de Pesquisa e Pós-Graduação HCPA Hospital de Clínicas de Porto Alegre HE Hematoxilina-eosina HEROES Helicobacter Eradication Relief of DyspEptic Symptoms HID High iron deamine, “diamina de ferro alto” H. pylori Helicobacter pylori HQ Histoquímica IHQ Imunoistoquímica INCA Instituto Nacional do Câncer kd Quilodalton Ki67 Marcador do índice da proliferação celular MI Metaplasia intestinal MIG Metaplasia intestinal gástrica mRNA Ácido ribonucléico, mensageiro OMS Organização Mundial da Saúde p16 Proteína que inibe o ciclo celular, dependente da ciclino-quinase p27 Proteína que inibe o ciclo celular, inibindo a quinase-1 p53 Regula expressão gênica PAS Periodic acid-Schiff, ácido Periódico de Schiff PBS Phosphate buffered saline, tampão fosfato-salino RT-PCR Reverse transcriptase-polymerase chain reaction, transcriptase reação reversa em cadeia da polimerase 7 TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido TGF-α Transforming growth factor-α, fator transformador do crescimento-α THBS1 Thrombospondin-1, trombospondina-1 TIMP-3 Tissue inhibitor of metalloproteinases-3, inibidor tecidual de metalloproteinases-3 TP53 Proteína tumoral p53 e está relacionada a vários tipos de tumores 8 8 1.1 Resumo A metaplasia intestinal gástrica (MIG) é considerada como lesão precursora para o câncer gástrico, mas isto não tem levado a um controle maior dos portadores. Estudamos uma população dispéptica adulta e detectamos a prevalência de MIG. Vários marcadores têm sido testados para indicar qual paciente portador de metaplasia intestinal deva ser acompanhado com exames periódicos. Um destes marcadores é a pesquisa da proteína de membrana CD44v6 em lesões pré-malignas. Objetivo: estudar a expressão da CD44v6 em pacientes dispépticos com Helicobacter pylori (H. pylori) e metaplasia intestinal gástrica. Local: Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Pacientes: 642 pacientes dispépticos dos quais foram estudados 56 pacientes com MIG e comparados com outros dois grupos, um de pacientes com H. pylori e outro, sem H. pylori e sem MIG. Métodos: estudo da MIG com colorações HE (hematoxilina-eosina), PAS/AB (periodic acid-Schiff/ Alcian blue), HID (high iron diamine) e, para estudar a expressão da CD44v6, empregou-se a imuno-histoquímica. Resultados: De 642 pessoas avaliadas, 424 eram portadoras de Helicobacter pylori e 218 não. Das portadoras, 77 tinham MIG (18,2%) e das não portadoras, 15 (6,9%). Das pessoas com MIG, estudamos 56 casos, sendo MIG do tipo I em 55% (31/56) dos casos, 22% (12/56) do tipo II e 23% (13/56) do tipo III. A MIG teve igual proporção entre os sexos, foi mais frequente no antro, o tipo de MIG não teve relação com a extensão da metaplasia e não houve aumento proporcional com a idade. Na nossa população de estudo, a MIG foi de baixa frequência relativa (14,4%). Quanto à CD44v6, todos os nossos casos foram negativos para esta proteína. Conclusões: 1) Os nossos casos foram todos negativos para CD44v6 e não vemos utilidade de utilizar este marcador no nosso meio no rastreamento de pacientes com metaplasia intestinal gástrica que mereceriam um acompanhamento subsequente. 2) Biópsias do antro e da incisura detectaram quase a totalidade (93%) dos casos de metaplasia intestinal gástrica nos nossos casos e isto pode ser uma indicação para a prática clínica. 3) A distribuição da metaplasia intestinal gástrica entre os sexos seguiu a proporção no grupo estudado, concluindo-se que não há diferença entre os sexos. 4) Não encontramos alteração da freqüência da metaplasia intestinal gástrica conforme a idade. 5) O achado de borda em escova ou células de Paneth não exclui que naquela lâmina haja glândulas metaplásicas do tipo incompleto. 6) Não houve relação entre o local da metaplasia intestinal gástrica e seu tipo. 7) Não houve relação entre extensão e tipo de metaplasia intestinal gástrica. 8) A população estudada tem baixa prevalência de metaplasia intestinal gástrica. 9 9 1.2 Abstract The gastric intestinal metaplasia (GIM) is considered a premalignant lesion for gastric cancer, but this has not led to greater control of the carriers. We studied a dyspeptic adult population and detected the prevalence of GIM. Several markers have been tested to indicate which patients with intestinal metaplasia should be followed with periodic examinations. One of these markers is the membrane protein CD44v6. Objective: To study the expression of CD44v6 in dyspeptic patients with Helicobacter pylori (H. pylori) and gastric intestinal metaplasia. Location: Hospital de Clinicas de Porto Alegre, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. Patients: 642 dyspeptic patients of which 56 patients with GIM and compared with two other groups, one of patients with H. pylori and another without H. pylori. Methods: A study of GIM with HE staining (hematoxylin-eosin), PAS / AB (periodic acid- Schiff / Alcian blue), HID (high iron diamine). We used immunohistochemistry (IHC) to study the expression of CD44v6. Results: Of 642 patients evaluated, 424 were carriers of Helicobacter pylori and 218 did not. The carriers had 77 MIG (18.2%) and noncarriers, 15 (6.9%). Of those GIM 56 study cases, GIM type I by 55% (31/56) cases, 22% (12/56) Type II and 23% (13/56) of Type III. GIM had equal sex ratio, was more frequent in the antrum, the type of GIM was not related to the extent of metaplasia and there was no proportional increase with age. In our study population, the GIM has low relative frequency (14.4%). As to CD44v6, all our cases were negative for this protein. Conclusions: 1 ) Our cases were all negative for CD44v6 and we do not see the usefulness of using this marker in screening patients with gastric intestinal metaplasia that merit a subsequent follow-up. 2) Biopsies of the antrum and incisura detected almost all (93 %) cases of gastric intestinal metaplasia in our cases and this can be an indication for clinical practice. 3) The distribution of gastric intestinal metaplasia between the sexes followed the proportion in the group studied, and so there is no difference between the sexes. 4) No change was found in the frequency of gastric intestinal metaplasia according to age. 5) The finding of brush border and Paneth cells does not preclude that metaplastic glands is not of the incomplete type. 6) There was no relationship between the location of gastric intestinal metaplasia and its type. 7) There was no relationship between the extent and type of gastric intestinal metaplasia. 8) The population has a low prevalence of gastric intestinal metaplasia. 10 10