Aus dem Universitätsklinikum Münster Klinik und Poliklinik für Allgemeine Chirurgie - Direktor: Univ.-Prof. Dr. N. Senninger - Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen- Mikrozirkulatorische Untersuchung zur Blockade der intestinalen Zelladhäsion - Eine tierexperimentelle Studie - INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des doctor medicinae der Medizinischen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster vorgelegt von Mike Laukötter aus Metelen 2004 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Westfälischen Wilhelms- Universität Münster Dekan: Univ.-Prof. Dr. med. H. Jürgens 1. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. C.F. Krieglstein 2. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. T. Kucharzik Tag der mündlichen Prüfung: 31. 08. 2004 Aus dem Universitätsklinikum Münster Klinik und Poliklinik für Allgemeine Chirurgie -Direktor: Univ. Prof. Dr. med. N. Senninger- Referent: Priv.-Doz. Dr. med. C.F. Krieglstein Koreferent: Priv.-Doz. Dr. med. T. Kucharzik ZUSAMMENFASSUNG PATHOGENESE CHRONISCH ENTZÜNDLICHER DARMERKRANKUNGEN- MIKROZIRKULATORISCHE UNTERSUCHUNG ZUR BLOCKADE DER INTESTINALEN ZELLADHÄSION Laukötter, Mike Einleitung: Die transendotheliale Migration von Leukozyten im Rahmen chronisch entzündlicher Darmerkrankungen (CED) wird durch die Interaktion von Zelladhäsionsmolekülen auf Leukozyten und auf Endothelzellen gesteuert. Ziel der vorliegenden Studie war es, mittels intestinaler Intravitalmikroskopie an einem CED-Rattenmodell (Bezirksregierung-Münster / Az.: 23.0835.1.0 - 20.12.1996) zu untersuchen, ob sich die Darmentzündung durch Antikörperblockade einzelner Zelladhäsionsmoleküle beeinflussen läßt. Zielmoleküle waren das von Leukozyten exprimierte Zelladhäsionsmolekül Mac-1 (CD11b) und sein endothelseitiger Ligand ICAM-1 (CD54). Methoden: 35 männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden in 5 Gruppen mit 7 Tieren eingeteilt. In 4 Gruppen wurde durch Indomethacin (s.c. Injektion 48h und 24h vor Untersuchung) eine chronische Darmentzündung induziert. Von diesen erhielten 3 Gruppen Antikörper: A) anti-Mac-1, B) anti- ICAM-1 und C) Kombination von beiden Antikörpern (je 1 mg/kg KG) 24h+12h vor Intravitalmikroskopie. In Narkose wurden pro Ratte 10 subserosale postkapilläre Sammelvenolen des entzündeten Darmabschnitts mikroskopiert und videodokumentiert. Validierte Scores wurden zur makroskopischen und histologischen Beurteilung des Entzündungsschadens herangezogen. Die restlichen Gruppen dienten als Kontrollen: D) entzündet und E) gesund. Ergebnisse: Die Entzündung war durch einen signifikanten Anstieg (P<0,05) der temporär adhärenten Leukozyten (Roller) (von 5,41 ± 2,79 auf 33,64 ± 14,56 /100 µm/30 sec) und der permanent adhärenten Leukozyten (Sticker) (von 0,16 ± 0,18 auf 11,06 ± 3,63 /100 µm/30 sec) charakterisiert. Nach anti- Mac-1 Gabe kam es, im Gegensatz zur anti-ICAM-1-Gruppe, die eine Verminderung, jedoch keine signifikante Reduzierung der Entzündungszellen erreichte, zu einer signifikanten (P<0,05) Reduzierung der Roller (von 33,64 ± 14,56 auf 6,60 ± 2,71) und der Sticker (von 11,06 ± 3,63 auf 0,07 ± 0,10). Die kombinierte Antikörpergabe zeigte eine signifikante (P<0,05) Verminderung der Roller (von 33,64 ± 14,56 auf 7,73 ± 3,60). Indomethacin führte zu einem Anstieg des Makroskopie- Scores von 0 auf 4,43 ± 0,79 Punkten (P<0,05), anti-CD11b zu einer Verminderung von 4,43 ± 0,79 auf 1,29 ± 1,11 Punkten (P<0,05) und die Kombination zu einer Verminderung von 4,43 ± 0,79 auf 1,57 ± 0,98 (P<0,05). Histologisch führte Indomethacin zu einem Anstieg des Scores von 0 auf 6,43 ± 1,27 Punkten (P<0,05), anti-CD11b zu einer Verminderung von 6,43 ± 1,27 auf 1,14 ± 2,04 (P<0,05) und die Kombination zu einer Verminderung von 6,43 ± 1,27 auf 0,29 ± 0,76 (P<0,05). Schlußfolgerung: Die Ergebnisse zeigen, daß die anti-Mac-1-Gabe ein effektiver Weg zur Reduzierung einer intestinalen Entzündung ist. In der Indomethacin induzierten chronischen Ileitis der Ratte besteht ein CD 18 unabhängiger, CD 11b (Mac-1) abhängiger Zelladhäsionsmechanismus im Komplex CD18/CD11b, der vielleicht auch ein vielversprechendes Ziel in der Behandlung von CED-Patienten sein kann. Tag der mündlichen Prüfung: 31. 08. 2004 Meinen Eltern Inhaltsverzeichnis Seite 1. Einleitung 1 2. Allgemeiner Teil 6 2.1 Anatomie und Physiologie des Rattendarmes 6 2.1.1 Darmepithel 6 2.2 Angioarchitektur 8 2.3 Morbus Crohn und Colitis ulcerosa 12 2.3.1 Befallsmuster 13 2.3.2 Epidemiologie 14 2.3.3 Ätiologie 15 2.3.4 Pathophysiologie 18 2.3.5 Klinik und Verlauf 21 2.3.6 Therapie-Übersicht 24 2.4 Adhäsionsmoleküle und Leukozyten-Endothelzell-Interaktion 26 2.4.1 Selektine und ihre Liganden 27 2.4.2 Integrine 32 2.4.3 Immunglobulinsupergenfamilie 35 2.5 Zelladhäsionskaskade 39 2.5.1 Leukozyten-Rolling 41 2.5.2 Stabile Zelladhäsion 42 2.5.3 Leukozyten-Endotheliale-Transmigration 43 3. Material und Methode 44 3.1 Versuchstiere 44 3.2 Narkoseverfahren 44 3.3 Operationstechnik 45 3.4 Indomethacin / Entzündungsinduktion 48 3.5 Versuchsgruppen 50 3.6 Intravitalmikroskopie 53 3.6.1 Technischer Aufbau der Geräte 53 3.6.2 Fluoreszenzfarbstoffe 54 3.6.3 Durchführung der Mikroskopie 59 3.6.4 Mikrozirkulatorische Untersuchungsparameter 62 3.7 Antikörper 63 3.7.1 Antikörper CD11b (Mac-1) 63 3.7.2 Antikörper CD54 (ICAM-1) 64 3.8 Morphologische Graduierung 64 3.8.1 Makroskopie-Score 64 3.8.2 Histologie-Score 65 3.8.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 66 3.9 Statistische Auswertung 67 4. Ergebnisse 68 4.1 Modelletablierung / Kontrollgruppen 68 4.1.1 In vivo Mikroskopie 68 4.1.2 Morphologie 72 4.1.3 Ergebniszusammenfassung der Modelletablierung 75 4.2 Hauptversuche 76 4.2.1 In vivo Mikroskopie 76 4.2.2 Morphologie 80 4.3 Zusammenfassung 83 5. Diskussion 84 5.1 In vivo Mikroskopie und Mikrozirkulation 84 5.1.2 Mikroskopie – Lokalisation 86 5.1.3 Intravitalmikroskopische Parameter 87 5.2 Rolle der Leukozyten in CED 89 5.3 Indomethacin induzierte intestinale Entzündung 93 5.4 Antikörperblockade von Mac-1 und ICAM-1 98 6. Zuammenfassung 103 7. Abkürzungsverzeichnis 106 8. Anhang 108 8.1 Ergebnistabellen 9. Literaturverzeichnis 111 10. Lebenslauf 143 11. Nachwort 152 Einleitung 1. Einleitung Ätiologie und frühe Pathogenese der ideopatischen chronisch-entzündlichen Darmer- krankungen (CED), Morbus Crohn (MC) und Colitis ulcerosa (CU) sind ungeklärt, doch weisen zahlreiche Veränderungen auf eine wichtige Rolle des intestinalen Immunsys- tems in der Pathogenese beider Krankheiten hin. Hierfür sprechen klinische Daten, wie z.B. die Remission von CED unter immunsuppressiver Therapie (Cortison, Cyclosporin, u.a.). Auch häufen sich experimentelle Daten, die eine Störung der intestinalen Immun- regulation generell als zentralen Pathogenesefaktor bei CED vermuten lassen (Strober W `93). Gewebeläsionen bei CED sind charakterisiert durch eine gesteigerte Akkumula- tion von Entzündungszellen in der Darmwand mit Beteiligung von T-Lymphozyten, neutrophilen Granulozyten und Monozyten. Szintigraphische Untersuchungen mit mar- kierten Leukozyten haben gezeigt, daß das lokale Zellinfiltrat vornehmlich durch Re- krutierung von zirkulierenden Zellen aus dem Blutstrom in die Darmwand entsteht (Saverymuttu SH `85). Dieser Wechsel vom vaskulären in das interstitielle Komparti- ment wird über eine sequentielle Expression und Aktivierung von spezifischen Zellad- häsionsmolekülen (CAMs) auf der Oberfläche von Leukozyten und Endothelzellen ge- steuert (Bevilaqua MP `93, Schürmann G `97, Panés J `98). Die Adhäsion zirkulieren- der Zellen an das Gefäßendothel findet in der frühen Phase der immunologischen Akti- vierung statt (Zimmermann GA `92) und scheint eine Voraussetzung dafür zu sein, daß zirkulierende Immunzellen transendothelial in das Gewebe migrieren, wo die Antigen- Erkennung und die Immunantwort stattfinden (Ala A `03). Nur ein kleiner Prozentsatz der immuno-inflammatorischen Zellen proliferiert in den CED-Läsionen lokal (Autsch- bach F `92). Somit sind Retention und Extravasation zirkulierender Leukozyten in Ent- zündungsgewebe wichtige Aspekte in der Pathogenese entzündlicher Darmerkrankun- gen (Schürmann G `97). Die Zelladhäsion verläuft dabei in einer Kaskade, an deren Schritte spezifische Adhäsionsmoleküle (sog. Selektine, Integrine und Mitglieder der Immunglobulin – Supergen - Familie) beteiligt sind (Bevilacqua MP `93, Raud J `93, Adams DH `94). Zelladhäsionsmoleküle der Selektin-Familie vermitteln die erste locke- re Kontaktaufnahme der Leukozyten mit den Endothelzellen, das sogenannte Leukozy- ten-Rolling (s. Abb. 1-B). Die Integrin-Familie (heterodimere Proteine auf der Leukozy- tenoberfläche mit α- und β- Untereinheiten) und die Immunglobulin-Familie der CAMs 1 Einleitung vermitteln durch ihre Interaktion die feste Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen (s.Abb. 1 - C+D) (Ala A `03). A. Zirkulierende Leukozyten C. Adhärente Leukozyten Ruhendes Endothel Aktiviertes Endothel B. Rollende Leukozyten D. Emigrierende Leukozyten Prä-aktiviertes Endothel Aktiviertes Endothel Abb. 1: Vier Blutgefäßquerschnitte als Schema der Leukozyten-Endothel-Interaktion (modifiziert nach Panés J `99). Viele Daten sprechen nun dafür, daß ein allgemeiner Mechanismus der Zelladhäsion besteht, der im Humansystem ubiquitär gleich abläuft und im Vergleich zu Säugern, sowie innerhalb dieser, große Gemeinsamkeiten aufweist. Zum Beispiel sind bei der Rekrutierung zirkulierender Zellen in transplantierten Organen (Taylor PM `92, Stein- hoff G `93) und bei Ischämie-Reperfusions-Studien (Zimmerman GA `91) gleiche Zell- adhäsionsmoleküle beteiligt, wie bei der Entstehung des Zellinfiltrates in entzündlichen Darmläsionen. Diese Veränderungen bei Colitis ulcerosa und Morbus Crohn sind wie- derum durch die Entwicklung von ulzerativen Läsionen und prominenten Leukozytenin- filtraten in der Darmwand charakterisiert. Studien, die die molekularen Determinanten der Leukozyten-Rekrutierung in chronisch entzündetes humanes Darmgewebe charakte- risierten, zeigten eine erhöhte Expression von β -Integrinen, ICAM-1 und E-Selektin in 2 Mukosabiopsaten (Malizia G `91, Koizumi M `92). Immunhistochemische Lokalisationsstudien zeigten eine vermehrte Expression von CD11a/CD18 durch mononukleäre Zellen. CD11b/CD18 war auf Granulozyten vermehrt exprimiert und ICAM-1 fand sich hauptsächlich in postkapillären Venolen. Die Intensität der Adhäsionsmolekül-exprimierung verlief hier parallel zu dem Entzündungsgrad (Naka- mura S `93). 2