Aus der Abteilung für Unfallchirurgie Direktor: Prof. Dr. M. Nerlich Medizinische Fakultät In-Vitro Studien zur lipolytischen Wirkung von Phosphatidylcholin im 3T3-L1 Adipozytenmodell Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin Der Medizinischen Fakultät der Universität Regensburg Vorgelegt von Silvan M. Klein 2010 Dekan: Prof. Dr. B. Weber 1. Berichterstatter: Prof. Dr. M. Nerlich 2. Berichterstatter: PD Dr. M. Jung Tag der mündlichen Prüfung: 27.09.2010 2 Gliederung 1. Einleitung.............................................................................................................................4 2. Hintergrund.........................................................................................................................4 2.1. Fettverteilungsstörungen............................................................................................4 2.2. Liposuktion....................................................................................................................5 2.3. Injektionslipolyse..........................................................................................................6 2.4. Fragestellung.................................................................................................................7 2.5. Lipolyse..........................................................................................................................7 2.5.1. Biochemische Lipolyse..........................................................................................7 2.5.2. Lyse von Lipiddoppelmembranen....................................................................10 2.3 Phosphatidylcholin......................................................................................................10 2.4 Desoxycholat................................................................................................................11 3. Methodik............................................................................................................................11 3.1 Zellkultur......................................................................................................................12 3.2 Lipolyse-Assay.............................................................................................................14 3.3 MTT-Assay...................................................................................................................15 3.4 Propidiumjodidfärbung..............................................................................................15 4. Ergebnisse..........................................................................................................................17 4.1 Kontrollen.....................................................................................................................17 4.2 Lipolyse-Assay.............................................................................................................17 4.3 MTT-Assay...................................................................................................................17 4.4 Propidiumjodidfärbung..............................................................................................17 4.5 Lichtmikroskopie.........................................................................................................18 5. Diskussion.........................................................................................................................22 6. Zusammenfassung...........................................................................................................23 7. Originalarbeit....................................................................................................................24 8. Verzeichnisse.....................................................................................................................33 8.1 Literaturverzeichnis....................................................................................................33 8.2 Abbildungsverzeichnis...............................................................................................34 9. Anhang...............................................................................................................................34 9.1 Danksagung..................................................................................................................34 9.2 Lebenslauf.....................................................................................................................35 9.3 Erklärung......................................................................................................................36 3 Erläuterungen zur Originalarbeit: In Vitro Studies Investigating the Effect of Subcutaneous Phosphatidylcholine Injections in the 3T3-L1 Adipocyte Model: Lipolysis or Lipid Dissolution? 1. Einleitung Die Ergebnisse dieser Versuchansätze wurden im August 2009 in einer Publikation unter dem Titel „In Vitro Studies Investigating the Effect of Subcutaneous Phosphatidylcholine Injections in the 3T3-L1 Adipocyte Model: Lipolysis or Lipid Dissolution?“ in dem Journal of Medizinischen Fakultät der Universität Regensburg sieht nach Paragraph 4, Absatz 4 die Vorlage einer Originalarbeit als Dissertationsarbeit vor, sofern der Doktorand als Erstautor auf dieser Originalarbeit aufgeführt wird. Die Promotionskommission verlangt zudem, dass dieser Originalarbeit eine zusätzliche Erläuterung zu den Einzelheiten der Publikation beigefügt wird; daher sollen die folgenden Ausführungen zu diesen Experimenten die Publikation weder übersetzen noch ersetzen. Vielmehr sollen Details zu dem Thema Lipolysetherapie, sowie zu den in dieser Arbeit angewandten Methodiken erläutert werden, die in der ursprünglichen Originalarbeit aufgrund der strikten Journalvorgaben keine Berücksichtigung fanden. 2. Hintergrund 2.1 Fettverteilungsstörungen Die pathogenetischen Ursachen für einen regionalen Überschuss an Unterhautfettgewebe sind im Einzelnen sehr unterschiedlich und bei weitem nicht immer - wie häufig fälschlicherweise angenommen - durch eine übermäßige Energiezufuhr bedingt. Neben häufigen hormonellen Dysfunktionen, wie beispielsweise dem durch Hypercortisolismus bedingtem Morbus Cushing, ist eine relativ seltene aber gravierende Ursache der Morbus Madelung. Während die 4 Lipomatose bei dem Hypercortisolismus in der Regel mit einer Einstellung der Serumcortisolkonzentration auf physiologische Spiegel rückläufig ist, stehen bei Erkrankungen wie dem Morbus Madelung – dessen Genese noch weitgehend unverstanden ist - nicht selten nur rein symptomatische Therapieoptionen zur Verfügung. 2,3,4 2.2 Liposuktion Zunächst ist hier die Liposuktion zu nennen, bei der im Wesentlichen das überschüssige Fettvolumen über eine Kanüle unter Sog entfernt wird. Bei der heute am häufigsten angewandten Liposuction werden zunächst mittels einer großlumigen Kanüle einige Liter einer Tumeszenslösung bestehend aus Lidocain und Vasokonstringentien eingebracht, welche die Adipozyten aus ihrem Gewebeverbund löst und zudem der folgenden Ödembildung als auch dem Blutverlust entgegenwirkt. Es folgt die mechanische Mobilisierung der Adipozyten aus ihrem Verbund mit der Liposuktionskanüle unter kontinuierlichem Aspiratorsog. Die gelösten Adipozyten werden nach ihrem Weg über die Kanüle in einen Auffangcontainer vor dem Aspirator gesammelt.5 Unbestrittene Vorteile dieser Methode sind sowohl die langjährige klinische Erprobung als auch eine effektive Volumenreduktion des Unterhautfettgewebes in kürzester Zeit. Doch muss trotz der Effektivität auch auf die Gefahren dieses Eingriffs hingewiesen werden. Neben allgemeinen Risiken operativer Eingriffe wie Wundinfektionen und Wundheilungsstörungen und den potentiellen Gefahren der hierfür in der Regel notwendigen Allgemeinanästhesie, enstehen Risiken durch das beträchtliche Ausmaß an entstandener Wundfläche. Neben Blutverlusten, insbesondere nach dem Abklingen Der Wirkung der intraoperativ eingebrachten Vasokonstriktoren, besteht die Gefahr eines allgemeinen Flüssigkeitsverlustes bis zum Vollbild des hypovolämischen Schockzustandes. Nicht zu unterschätzen ist zudem die Gefahr der akzidentiellen Penetration von Organen, wie beispielsweise des Gastrointestinaltraktes oder des Thorax, durch das mechanische Lösen der Adipozyten mit der Liposuktionskanüle. Beschreibungen zu Fällen von unbemerkten Darmpenetrationen finden sich wiederholt in der Literatur.Die Anwendung dieser Methode sollte daher ausschließlich durch Fachärzte für Plastische- und Ästhetische Chirurgie erfolgen.6 Neben der teilweise nicht unerheblichen funktionellen Einschränkungen durch die Lipomatose - vor allem in der Cervikalregion - sollte der enorme Leidensdruck der 5 betroffenen Patienten nicht außer Acht gelassen werden.7 Sowohl diätetische Maßnahmen als auch ein erhöhtes Maß an Sport, führen nicht zu einer Reduktion der Lipomatose. Spontanremissionen sind beispielsweise für den Morbus Madelung bisher nicht beschrieben. 2.3 Injektionslipolyse Aufgrund den beschriebenen Nachteile der Liposuktion wurden in den letzten Jahren verstärkt Anstrengungen unternommen, die Liposuktion, insbesondere bei geringeren Volumenüberschüssen, durch risikoärmere Therapiemethoden zu ersetzen. Hier erfolgte der Einsatz nach einer Publikation von Rittes et al. besonders der Einsatz von Phosphatidylcholin.8 Die Autoren haben erstmals die klinische Beobachtung einer Volumenreduktion nach subkutaner Applikation von Phosphatidylcholin beschrieben. In Europa kommt für diese „Lipolysetherapie“ in der Regel das in Desoxylcholat gelöste Phosphatidylcholin zum Einsatz, welches in Deutschland unter dem Handelsnamen Lipostabil® vertrieben wird. Lipostabil® fand seine Markteinführung in den 1970er Jahren als intravenös applizierbares Arzneimittel zur Therapie und Prävention von Fettembolien; somit handelt es sich bei der Therapie von Fettverteilungsstörungen mit dem Medikament Lipostabil® um einen sog. doppelten „Off-Label-Use“, da dieses Arzneimittel behördlicherseits weder zur subkutanen Applikation noch zur Volumenreduktion von subkutanem Fettgewebe zugelassen ist. Daher überrascht es kaum, dass die Studienlage zu dieser Anwendung äußerst mäßig ist. Neben weiteren Veröffentlichungen klinischer Studien, die den vorbeschriebenen volumenreduzierenden Effekt stützen, existiert eine weitere experimentelle Studie, bei der jedoch kein in-vitro Adipozytenmodell zur Anwendung kam.8,9 Daher besteht nur eine fragliche Übertragbarkeit der gewonnen Daten auf die in-vivo Situation. Vor diesem Hintergrund wird die Frage, welche Substanz in Lipostabil® lipolytisch wirksam ist und wodurch der lipolytische Effekt tatsächlich zustande kommt nach wie vor kontrovers diskutiert. Dabei gilt es genau zwischen den Begrifflichkeiten lipolytisch, im Sinne eines biochemischen Enzymkatabolismus und lipolytisch im Sinne einer Zelllyse von Adipozten zu differenzieren. Obwohl ein volumenreduzierender Effekt letztlich sowohl bei Ersterem als auch bei Letzterem zu erwarten wäre, ist eine Unterscheidung in Bezug auf potenzielle Risiken und Grenzen der Therapie unabdingbar. 6 2.4 Fragestellung Diese Studie zielt darauf ab, die einzelnen Substanzen in Lipostabil auf ihren lipolytischen Charakter hin zu überprüfen. Im einzelnen sollen die in Lipostabil® enthaltenen Einzelsubstanzen isoliert und in Kombination auf ihre lipolytische und cytotoxische Aktivität hin geprüft werden; zudem werden durch die Prüfung der Einzelkomponenten in unterschiedlicher Kombination eventuelle synergistische Effekte der Einzelsubstanzen berücksichtigt. Schließlich soll diese Studie Aufschluss über den tatsächlichen Wirkmechanismus des beschriebenen volumenreduzierenden Effektes von Phosphatidylcholin bringen. 2.5 Lipolyse 2.5.1 Biochemische Lipolyse Bei der biochemischen Lipolyse handelt sich um einen sowohl durch α - als auch 2 durch β -rezeptoren induzierten Enzymkatabolismus. Die Erkennung des 1 Rezeptorliganden am Transmembranrezeptor führt zur Phosphorylierung von Guanin-Di-Phosphat (GDP), welches damit zu Guanin-Tri-Phosphat (GTP) wird. Guanin-Tri-Phosphat selbst wiederum induziert an einem cytoplasmaseitigen membranständigen Rezeptor die Umsetzung von Adenosin-Tri-phosphat (ATP) zu cyklischem Adenosin-Mono-Phosphat (cAMP) welches dann über die Aktivierung einer Proteinkinase die Triglycerinlipase aktiviert (Abb. 1a). Die aktivierte Triglcerinlipase spaltet hydrolytisch die aus Glycerol und jeweils drei Fettsäureresten bestehenden Triglyceride, die anschließend durch Veresterung mit Cholesterin über Serumlipoproteine dem Lebermetabolismus zugeführt werden (Abb. 1b).10 7 Abbildung 1a - Signaltransduktion der biochemischen Lipolyse 8 Abbildung 2b - Schematische Darstellung des Triacylglyceridstoffwechsels 9 2.5.2 Lyse von Lipiddoppelmembranen Die lytische Durchbrechung der Membranintegrität, ist ein nicht-enzymvermittelter Prozess bei dem Substanzen mit Detergenzwirkung die Zellmembran durch Mizellenbildung mit Membranlipiden zerstören und somit den nekrotischen Untergang der Zelle einleiten (Abb. 2). Abbildung 3 - Schematische Darstellung der Membranlyse durch ein Detergenz 2.3 Phosphatidylcholin Bei Phosphatidylcholin, auch als Lecithin bezeichnet, handelt es sich um ein Lipid aus der Gruppe der Phosphoglyceride. Phosphoglyceride bestehen aus zwei an Glycerin gebunden Fettsäuren sowie über einen Phosphodiester gebundene weitere funktionelle Gruppe. An Phosphatidylcholin ist ein negativ geladener Cholinrest gebunden, welcher gemeinsam mit dem Phosphation für den Zwitterionischen Charakter von Phosphatidylcholin verantwortlich ist (Abb. 3).11 Phosphatidylcholin ist durch seinen bipolaren Charakter Bestandteil zahlreicher Biomembranen sowie auch des in den Lungenalveolen vorkommenden Surfactant. 10