Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie der Universität Würzburg Lehrstuhl für Anatomie II Vorstand: Prof. Dr. med. D. Drenckhahn zum Thema Bedeutung der Rho-GTPasen für desmosomale Adhäsion und Pemphigus-Pathogenese Inaugural - Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Julius-Maximilians-Universität Würzburg vorgelegt von Volker Bernd Spindler aus Würzburg Würzburg, Oktober 2008 Referent: Prof. Dr. med. Detlev Drenckhahn Koreferent: Prof. Dr. med. Eva-Bettina Bröcker Dekan: Prof. Dr. med. Matthias Frosch Tag der mündlichen Prüfung: 18.09.2009 Der Promovend ist Arzt für Dani Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1 1.1 Epidermis 1 1.2 Interzellularkontakte 1 1.3 Desmosom 2 1.4 Desmocadherine 4 1.5 Pemphigus 7 1.5.1 Pathogenese des Pemphigus 10 1.6 Rho (Ras homologe)-GTPasen 14 1.6.1 Aufbau und Funktionsprinzip 14 1.6.2 Regulation 15 1.6.2.1 GEFs 15 1.6.2.2 GAPs 16 1.6.2.3 GDIs 16 1.6.3 Funktionen der Rho-GTPasen 17 1.7 Fragestellung 18 2 MATERIAL UND METHODEN 20 2.1 Zellkultur 20 2.2 Bakterielle Toxine 21 2.3 Antikörper und Testreagenzien 23 2.3.1 Primärantikörper 23 2.3.2 Sekundärantikörper 24 2.3.3 Testreagenzien 24 2.4 Desmoglein-Fc-Proteinaufreinigung 24 2.5 Aufreinigung der Patienten- und Kontroll-Antikörper 25 2.6 Indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie 26 2.7 Proteinkonzentrationsbestimmung 27 2.7.1 Bradford-Methode 27 2.7.2 Amidoschwarz-Methode 27 2.8 SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) 28 2.9 Westernblotting und Immundetektion von Proteinen 29 IV 2.10 Messung der Aktivität von Rho-GTPasen mit Pulldown-Versuch 30 2.11 Proteinextraktion 31 2.12 Laserpinzette 32 2.12.1 Beschichtung der Protein-A-Mikroperlen mit den Dsg-Fc-Konstrukten 32 2.12.2 Prinzip der Laserpinzettentechnik 33 2.12.3 Durchführung der Versuche mit der Laserpinzette 34 2.13 ex vivo-Hautmodell 34 2.14 Auswertung des Bild- und Datenmaterials 37 3 ERGEBNISSE 38 3.1 Bedeutung der Rho-GTPasen für die Integrität der Epidermis 38 3.2 Einfluss der Rho-GTPasen auf die Zelladhäsion in kultivierten Keratinozyten 40 3.3 Rolle der Rho-GTPasen in der Regulation der durch Desmogleine vermittelten Adhäsion 43 3.4 Wirkung von Pemphigus-IgG auf humane Epidermis ex vivo 44 3.5 Effekte der Aktivierung von Rho-GTPasen auf die durch Pemphigus- IgG vermittelte Akantholyse in humaner Epidermis ex vivo 49 3.6 Einfluss einer Aktivierung von Rho-GTPasen auf die durch Pemphigus-IgG vermittelte Zelldissoziation in kultivierten Keratinozyten 52 3.7 Wirkung von Pemphigus-IgG auf die durch Desmogleine vermittelte Adhäsion in kultivierten Keratinozyten 55 3.8 Einfluss von Pemphigus-IgG auf die Aktivität von Rho A 57 3.9 Bedeutung von p38MAPK für die durch Pemphigus-IgG vermittelte Inaktivierung von Rho A 59 3.10 Mechanismen der Rho A-vermittelten Regulation der desmosomalen Adhäsion bei Pemphigus 60 4 DISKUSSION 63 4.1 Rho-GTPasen sind an der Regulation der desmosomal vermittelten Haftung beteiligt 63 4.1.1 Rho-GTPasen beeinflussen die zelluläre Adhäsion und die Lokalisation von Desmogleinen 63 V 4.1.2 Rho GTPasen modulieren die Desmoglein-vermittelte Haftung 64 4.2 Rho A ist an der Pemphigus-Pathogenese beteiligt 66 4.2.1 Pemphigus-IgG vermindern die Aktivität von Rho A 66 4.2.2 Die Desmoglein-Kompensationstheorie erklärt die Pemphigus-Pathogenese nicht vollständig 68 4.2.3 Die Entstehung von Hautblasen kann als ein mehrstufiger Prozess verstanden werden 70 4.3 Ausblick 73 5 ZUSAMMENFASSUNG 75 6 LITERATUR 77 7 ANHANG 88 7.1 Abkürzungsverzeichnis 88 7.2 Danksagungen 91 7.3 Lebenslauf 92 VI 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Epidermis Als Epidermis bezeichnet man die oberhalb der Dermis gelegene äußerste Schicht der Hautdecke mit einer Dicke von ca. 0,05-0,1 mm (Drenckhahn, 2008). Die Keratinozyten sind die Hauptbestandteile der Epidermis und wandern im Laufe ihres Lebenszyklus von der tiefsten Epidermisschicht nach außen, bis sie schließlich durch mechanische Beanspruchung abgelöst werden. Die Epidermis lässt sich in vier Schichten einteilen (siehe auch Abb. 2). Das Stratum basale besteht aus einer einzelnen Lage an Zellen, die alle der Basalmembran aufsitzen. Diese Schicht ist Sitz der dermalen Stammzellen und Ausgangspunkt für Regeneration und Erneuerung der Epidermis. Oberhalb des Stratum basale liegt das Stratum spinosum, gefolgt von einem nur wenige Zelllagen dicken Stratum granulosum. In dieser Schicht beginnt der Verhornungsprozess. Die äußersten Zellreihen bestehen nur noch aus toten, zellkern- und orgenellenlosen Hornzellen und werden Stratum corneum genannt. Die Epidermis besitzt zusammen mit Dermis und Unterhaut lebenswichtige Funktionen. So muss sie einen mechanischen Schutz vor schädigenden Einwirkungen vielfältigster Art von außen bieten und dabei einen Wasserverlust nach außen verhindern. Trotzdem ermöglicht sie unter bestimmten Voraussetzungen einen Stofftransport nach innen, was beispielsweise für die topische Applikation von Medikamenten relevant ist. Weiterhin reguliert sie den Wärmehaushalt des Körpers und ist Sitz von Rezeptoren, die Schmerz-, Temperatur- und Empfindungsreize vermitteln. 1.2 Interzellularkontakte In einem Zellverbund sind die Kontakte zwischen den Zellen von elementarer Bedeutung für Stabilität, Integrität und die Aufrechterhaltung der Barrierefunktion. Die Interzellularkontakte lassen sich einteilen in Adhäsionskontakte mit überwiegend mechanischer Funktion wie Adhärenskontakte und Desmosomen, solchen mit metabolischer und elektrisch koppelnder Funktion wie die Nexus und schließlich solchen, die die Abdichtung 1 1 Einleitung des Interzellularraumes zur Aufgabe haben, wie die Zonulae occludentes (Drenckhahn, 2008). Die Ausstattung der Zellen mit den jeweiligen Interzellularkontakten ist abhängig von den Aufgaben des entsprechenden Zellverbundes. In der Epidermis herrschen daher die vor allem mechanischen Zusammenhalt vermittelnden Desmosomen zusammen mit den Adhärenskontakten vor. Im Stratum granulosum lassen sich zusätzlich Zonulae occludentes nachweisen, die der Abdichtung des Epithels nach außen dienen. Desweiteren besitzt die Basalzellschicht Hemidesmosomen, die die Haftung der Zellen an die Basallamina vermitteln. Adhärenskontakte lassen sich in Adhärenspunkte (Punctum adherens), -gürtel (Zonula adherens) und -platten (Fascia adherens) unterteilen. Die im Interzellularspalt die Haftung vermittelnden Proteine sind die klassischen Cadherine. Deren Verteilung ist abhängig vom jeweiligen Zelltyp. So finden sich N-Cadherine vorwiegend in Neuronen und Muskelzellen, VE-Cadherin wird nur im Endothel exprimiert und E-Cadherin dominiert in Epithelien. Die Cadherine sind über Proteine der Cateninfamilie (α-, β-, γ-, δ-Catenin) mit dem Aktinzytoskelett verbunden. Neben ihrer Rolle bei der zellulären Adhäsion agieren Adhärensjunktionen auch als Rezeptoren, die Signale aus dem Umfeld der Zelle durch Beeinflussung verschiedener Signalkaskaden nach innen weiterleiten. Insbesondere β-Catenin und das meist als Plakoglobin bezeichnete γ-Catenin können auch in den Zellkern translozieren und dort als Transkriptionsregulator wirken. So sind Adhärensjunktionen wichtige Regulatoren von Proliferation, Überleben, Migration und Morphogenese von Zellen und Geweben (Erez et al., 2005). 1.3 Desmosom Der Begriff Desmosom entstammt einer Kombination der griechischen Wörter „desmos“ (Bindung) und „soma“ (Körper). Der Name wurde erstmals 1920 von Josef Schaffer in seinem Histologiebuch eingeführt, wobei die Struktur an sich schon seit dem 19. Jahrhundert bekannt ist (Waschke, 2008). Desmosomen sind fleckförmige Haftkontakte mit einer Größe von durchschnittlich 0,1-0,5 µm. Sie vermitteln extrazellulär die Haftung an benachbarte Zellen und sind intrazellulär mit dem Intermediärfilamentgerüst der Zelle verbunden. Sie werden 2 1 Einleitung in großer Zahl in Bereichen mit starker mechanischer Belastung wie der Epidermis, dem mehrschichtig unverhornten Plattenepithel von Mundhöhle, Speiseröhre und Vagina sowie dem Myokard gefunden, aber auch zwischen Neurothelzellen der harten Hirnhaut und follikulär dentritischen Zellen des Lymphknotens (Drenckhahn, 2008). Elektronenmikroskopisch lassen sich folgende Strukturelemente darstellen: Ein interzellulärer Anteil, die Desmoglea, mit einer elektronendichten Linie in der Mitte des Interzellularspaltes (Mesophragma) sowie eine intrazelluläre plasmamembran-nahe Verdichtung, die desmosomale Plaque (Abb. 1). Abb 1: Schema eines Desmosoms Links das Schema einer Desmosomenhälfte, rechts eine korrespondierende elektronenmikroskopische Aufnahme. Dsg und Dsc durchspannen die Plasmamembran (PM). Mit der N-terminal gelegenen EC-1 Domäne interagieren sie mit gegenüber liegenden Desmocadherinen und bilden das elektronenoptisch sichtbare Mesophragma (MP). C-terminal binden Dsg und Dsc ‚a‘ über Plakoglobin (PG) an Desmoplakin (DMP) im Bereich der äußeren Membranplaque (ÄMP). Dsc ‚b‘ ist in der Lage, mit Plakophilinen (PKP) zu assoziieren. In die innere Membranplaque (IMP) strahlen Intermediärfilamente (IF) ein und binden dort an Desmoplakin. Modifiziert nach Getsios et al. 2004. Diese lässt sich unterteilen in eine äußere und innere Membranplaque. Im Interzellularspalt befinden sich die Desmocadherine Desmoglein (Dsg) 1-4 und Desmocollin (Dsc) 1-3. Diese durchspannen die Plasmamembran und strahlen mit ihrem Carboxy-terminalen Ende in die äußere Membranplaque ein. Hier binden sie an Plakoglobin, einem Protein der Armadillo-Familie, das auch in Adhärensjunktionen zu finden ist (siehe auch 1.2). Die ebenfalls aus der 3 1 Einleitung Armadillo-Familie stammenden Plakophiline (1-3) zeigen ein gewebespezifisches Verteilungsmuster und interagieren mit verschiedenen desmosomalen Proteinen wie Dsgs und Dscs, Plakoglobin, Desmoplakin sowie Intermediärfilamenten. Es scheint möglich zu sein, dass Plakophilin 1 bei Plakoglobin-Defizienz die fehlende Verknüpfungsfunktion kompensiert (Ruiz et al., 1996). Das aus der Plakinfamilie stammende Desmoplakin durchzieht sowohl die äußere wie auch die innere Membranplaque und bindet in ersterer an Plakoglobin und in letzterer an in Bündeln einstrahlende Intermediärfilamente. Diesen Elementen des Zytoskeletts wird eine vorwiegend passive Stützfunktion zugeschrieben, zusammen mit einer Mitwirkung bei der Positionierung von Zellkompartimenten wie dem Nukleus, den Mitochondrien und dem Golgi-Komplex (Godsel et al., 2008). Im Epithel sind die Intermediärfilamente aus Zytokeratinen aufgebaut. In basalen Zellen der Epidermis dominieren die Zytokeratine 5 und 14, während in oberen Schichten vor allem Zytokeratin 1 und 10 exprimiert werden (Uitto et al., 2007). Relativ wenig bekannt ist über das kürzlich entdeckte Perp, ein Protein, das in komplexen Epithelien in den Desmosomen lokalisiert ist (Ihrie et al., 2005). Interessant hierbei ist jedoch die Tatsache, dass neugeborene Perp-defiziente Mäuse Blasenbildung in der Epidermis entwickeln und rasch versterben (Marques et al., 2006). Desmosomen wurden lange Zeit vornehmlich als Strukturen angesehen, die extrazellulär das Anhaften an die Nachbarzelle vermitteln sowie intrazellulär der Verankerung des Intermediärfilamentsystems an der Plasmamembran dienen. In den letzten Jahren häufen sich Erkenntnisse, dass Desmosomen bzw. deren Strukturproteine auch wichtige Aufgaben bei Entwicklung und Differenzierung der Epidermis übernehmen (Rickman et al., 1999; Zhurinsky et al., 2000; Caldelari et al., 2001; Getsios et al., 2004a; Yin et al., 2005). 1.4 Desmocadherine Cadherine sind Calcium-bindende Proteine, die unter Anwesenheit dieses Ions untereinander Bindungen eingehen können (Volberg et al., 1986). Die desmosomalen Vertreter der Cadherin-Familie sind die Desmocadherine genannten Dsg 1-4 und Dsc 1-3. Diese sind, wie auch die klassischen 4