Antimicrobial Effect of Olive Leaf Products of Extracted from Different Variety of Olive Leaves on Escherichia coli O157:H7 and Salmonella Typhimurium S.Topuz1, M. Bayram*1 1Department of Food Engineering, Faculty of Natural Sciences and Engineering, Tokat Gaziosmanpaşa University, Tokat, Turkey Abstract Oleuropein is heterosidic ester of elenolic acid and 3,4-dihydroxyphenylethanol that is a predominant phenolic compounds in olive leaves. The content of phenolic compounds and oleuropein in olive leaf is different from depending on some conditions such as variety, climate, geographical region. In this study it was aimed to determine minimum inhibitory concentrations (MICs) on E. coli O157:H7 and S. Typhimurium of olive leaf crude extract, partially purified oleuropein, purified oleuropein samples which are obtained from different olive leaves. Olive leaves belonging of Domat, Edremit and Trilye varieties were gathered in Aegean Region (Manisa Province) in August. Olive leaf crude extract was obtained solid-liquid extraction technique by using methanol. Partially purified oleuropein extract was obtained from crude olive leaf extract. After than, partially purified oleuropein extract was fractionated on Sephadex LH-20 and determined some fractions were combined. Thus, purified oleuropein extract was obtained. Antimicrobial activity of 10 % (w/v) solutions of these extracts were determined against test microorganisms by MIC "Gradient Plate" method. The MIC values of these products were found ranging from between 1:2 (5 %) to 1:16 (0,625 %) for S. Typhimurium. The MIC values of these products were found ranging from between 1:1 (10 %) to 1:4 (2,5 %) for E. coli O157:H7. Partially purified oleuropein and purified oleuropein were found to be more effective on E.coli O157:H7 and S. Typhimurium than olive leaf crude extracts. The results of MIC tests indicated that olive leaf crude exract, partially purified oleuropein, purified oleuropein showed inhibitory effect on test microorganisms. Keywords: Olive leaf, oleuropein, minimum inhibitory concentration (MIC), Escherichia coli O157:H7, Salmonella Typhimurium 1.GİRİŞ Zeytin, botanik orijin sınıflandırma sistemine göre 29 cinse ve yaklaşık 600 türe sahip Oleaceae familyasının [1], Olea cinsinin Olea europa türünün Olea europa sativa alt türüne dahildir [2]. Dünyanın pek çok yerinde yetiştirilen zeytin ağacının temel alanı % 98 üretim payı ile Akdeniz Bölgesi’dir [3]. Türkiye’de ise tarım yapılan alanlarımızın yaklaşık %2’sini; bağ, bahçe tarımı yapılan alanlarımızın ise yaklaşık %22’sini zeytin tarımı yapılan alanlar oluşturmaktadır. Bölgelerimizde zeytin ağaç sayısı ve üretim miktarı çoktan aza doğru Ege Bölgesi, Marmara Bölgesi, Akdeniz Bölgesi, Güneydoğu Anadolu Bölgesi ve Karadeniz Bölgesi şeklinde sıralanmaktadır [4]. Zeytin ağacı yetiştiriciliğinde ve zeytin işleme endüstrisinde çok sayıda atık madde meydana gelmektedir. Bu atık ürünlerin birçoğu pratik uygulamalara sahip değildir. Zeytin yaprağı da, bu atık ürünlerden birisidir ve fenolik bileşiklerin potansiyel bir kaynağıdır [5]. Zeytin yaprağının antioksidan [6], antimikrobiyal [7], hipokolesterolemik [8], kardiyoprotektif [9] gibi birçok etkiye sahip olduğu bildirilmektedir. Zeytin yaprağının sahip olduğu bu yararlı etkiler yapısında bulunan fenolik bileşiklerle ilişkilendirilmektedir [3]. Zeytin yapraklarının en baskın fenolik bileşiği oleuropeindir [10]. Oleuropein bileşiği ilk kez 1908 yılında Bourquelot ve Vintilesco tarafından keşfedilmiş ve bu bileşiğin yapısı ise 1960 yılında tanımlanmıştır [11] Elenolik asit ve 3,4-dihidroksifeniletanolün heterozidik esteri olan oleuropein, zeytin meyvesi ve yaprağında doğal olarak bulunmaktadır [12]. Bu molekül hidroksitirisol olarak bilinen 4-(2-hidroksietil) benzen-1,2-diol, *Corresponding author. Tel.: +90 356-252-1616/2886: fax: +90 356-252-1729. E-mail address: [email protected] (M. Bayram). 880 elonolik asit olarak adlandırılan sekoiridoid ve glikoz molekülü olmak üzere üç yapısal birimden oluşmaktadır [13]. Oleuropeini önemli kılan nedenlerden biri de sahip olduğu antimikrobiyal etkidir [14]. Çünkü günümüzde, gıda kaynaklı patojenler çeşitli gıdalar aracılığıyla insan sağlığına önemli derecede olumsuz etkide bulunan salgınlara neden olabilmektedir. Bu nedenle, gıda kaynaklı patojenlerin kontrolü gıda endüstrisi için büyük önem arz etmektedir. Gıda kaynaklı patojenler, sentetik ve doğal antimikrobiyal bileşikler olarak sınıflandırılabilen gıda koruyucularının kullanılması ile kontrol altına alınabilmektedir. Bitkisel antimikrobiyal maddeler, sentetik gıda koruyucularına kıyasla, genellikle daha güvenli olarak kabul edilmekte ve insan sağlığına yararlı etkileri olabileceğinden daha fazla dikkat çekmektedir [15]. Oleuropein antimikrobiyal etkisini, diğer fenolik bileşiklerde olduğu gibi bakteriyel membranlara zarar vererek veya hücrenin peptidoglukan tabakasını bozarak göstermektedir. Oleuropein ve membran lipitler arasındaki etkileşimi tam anlamıyla açıklayabilmek için birçok çalışma yapılmıştır. Bazı araştırmacılara göre bu etkinin nedeni oleuropeinin sahip olduğu orto-difenol yapısıdır. Ancak oleuropeinin antimikrobiyal mekanizması henüz kesin olarak aydınlatılamamıştır [16]. Bu çalışmada, farklı zeytin çeşidi yapraklarından elde edilen zeytin yaprağı ham ekstraktı, kısmi saflaştırılmış oleuropein ve saflaştırılmış oleuropeinin E. coli O157:H7 ve S. Typhimurium’a karşı minimum inhibisyon konsantrasyonunun (MİK) belirlenmesi amaçlanmıştır Bu amaçla, (i) zeytin yaprağından; zeytin yaprağı ham ekstraktı, kısmi saflaştırılmış oleuropein ve saflaştırılmış oleuropein elde edilmesi, (ii) elde edilen ekstraktların E.coli O157:H7 ve S. Typhimurium’a karşı antimikrobiyal etkisinin ve MİK değerinin tespit edilmesi hedeflenmiştir. 2.MATERYAL ve METOT 2.1. Materyal 2.1.1. Bitkisel Materyal Araştırmada, oleuropein bileşiğinin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için aynı yetiştirme koşulları altında ve aynı bölgede (Ege Bölgesi) ve aynı yörede (Manisa, Tilkisüleymaniye Köyü) bulunan 3 farklı çeşit (Domat, Edremit, Trilye) zeytin ağacına ait zeytin yaprakları 2017 yılının Ağustos ayında toplanmıştır. Toplanan zeytin yaprakları kurutulmuş ve polipropilen torbalar içerisinde Gaziosmanpaşa Üniversitesi, Kimya Bölümü, Bitki Araştırma Laboratuvarına getirilmiştir. Zeytin yaprakları ekstraksiyon işlemine kadar polipropilen torbalar içerisinde, laboratuvar koşullarında saklanmıştır. 2.1.2. Kimyasal Materyal Metanol, etil asetat, Tekkim (Bursa), % 80 saflıktaki oleuropein, Sigma-Aldrich (Almanya), triptik soy agar, triptik soy broth, Lab M (Lancashire, İngiltere) bakteriyolojik pepton, Laboratorios Conda (İspanya) firmalarından temin edilmiştir. 2.1.3. Test Kültürleri Araştırma kapsamında Escherichia coli O157:H7 (ATCC 25922), Salmonella Typhimurium (ATCC 14028), Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi, Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü, Mikrobiyoloji Laboratuvarından temin edilmiştir. Analizler öncesi S. Typhimurium ve E.coli O157:H7 37±2°C’de, 18-24 saat triptik soy broth besiyerinde iki kez geliştirilerek aktive edilmiştir. 2.2. Metot 2.2.1. Zeytin Yaprağından Ekstraktların Elde Edilmesi Zeytin Yaprağı Ham Ekstrakt Eldesi: Öğütülmüş zeytin yapraklarından 200 g ekstraksiyonun yapılacağı kaba tartılmış daha sonra numune üzerine 1 L metanol eklenmiş ve oda sıcaklığında 5 saat ekstraksiyona bırakılmıştır. Ekstraksiyon işlemi sonunda, ekstrakt filtre edilerek elde edilen süzüntü toplama kabına alınmıştır. İlk ekstraksiyon sonrası kalan posa 2 kez daha aynı ekstraksiyon işlemine tabi tutulmuştur. 3 ekstraksiyon işlemi sonrasında elde edilen süzüntüde bulunan metanol, rotary evaporatör de uzaklaştırılmıştır. Kısmi Saflaştırılmış Oleuropein Eldesi: Zeytin yaprağı ham ekstraktından bir miktar behere tartılıp üzerine sıcak su eklenmiş ve ekstraktın sıcak suda çözünmesi sağlanmıştır. Daha sonra kaba filtre kağıdı yardımı ile süzme işlemi gerçekleştirilmiştir. Filtrasyon sonrasında elde edilen süzüntü etil asetat ile karıştırılıp, çalkalanmış ve karışım ayırma hunisine alınmıştır. Sıvı-sıvı ekstraksiyon sonrasında ayırma hunisinden ayrılan etil asetatlı kısım rotary evaporatörde uzaklaştırılmıştır. Saflaştırılmış Oleuropein Eldesi: Kısmi saflaştırılmış oleuropeinden metanolde çözündürülmüş ve Sefadeks LH-20 üzerinde fraksiyonlandırılmıştır. Hareketli faz olarak metanol kullanılmıştır. 881 Oleuropein içeren fraksiyonlar ince tabaka kromatografi (TLC) yardımı ile belirlenmiştir. Ticari firmadan temin edilen oleuropeinin fraksiyonlarının TLC’de belirlenmesiyle toplanacak fraksiyonlar saptanmıştır. Oleuropein bileşiği olduğu tespit edilen fraksiyonlarda bulunan metanol rotary evaporatör yardımı ile uzaklaştırılmıştır. 2.2.2. Ekstraktların E. coli O157:H7 ve S. Typhimurium’a Karşı Minimum İnhibisyon Konsantrasyonlarının (MİK) Belirlenmesi Farklı zeytin çeşidi yapraklarından elde edilen zeytin yaprağı ham ekstraktı, kısmi saflaştırılmış oleuropein ve saflaştırılmış oleuropeinin destile su ile % 10’luk çözeltileri hazırlanmış ve E.coli O157:H7 ve S. Typhimurium’a karşı antimikrobiyal aktivitesi MİK "Gradient Plate" yöntemi ile belirlenmiştir [17]. 3.BULGULAR VE TARTIŞMA Domat çeşidine ait zeytin yaprağı ham ekstraktı, kısmi saflaştırılmış oleuropein ve saflaştırılmış oleuropeinin E.coli O157:H7 için sırası ile 1:1 (%10), 1:4 (%2.5), 1:4 (%2.5) olarak belirlenirken, S. Typhimurium için MİK değerleri sırası ile 1:2 (%5), 1:8 (% 1.25), 1:8 (% 1.25) olarak tespit edilmiştir. Edremit çeşidine ait zeytin yaprağı ham ekstraktı, kısmi saflaştırılmış oleuropein ve saflaştırılmış oleuropeinin E.coli O157:H7 için sırası ile 1:1 (%10), 1:4 (%2,5), 1:2 (%5) olarak belirlenirken, S. Typhimurium için MİK değerleri sırası ile 1:2 (%5), 1:16 (% 0.625), 1:8 (% 1.25) olarak tespit edilmiştir. Trilye çeşidine ait zeytin yaprağı ham ekstraktı, kısmi saflaştırılmış oleuropein ve saflaştırılmış oleuropeinin E.coli O157:H7 için ise sırası ile 1:1 (%10), 1:2 (%5), 1:2 (%5) olarak belirlenirken, S. Typhimurium için MİK değerleri sırası ile 1:2 (%5), 1:8 (% 1.25), 1:8 (% 1.25) olarak tespit edilmiştir. Tablo. I. Ekstraktların test mikroorganizmalarına karşı belirlenen MİK değerleri Kullanılan Antimikrobiyal Bileşik Test Mikroorganizmaları E.coli O157:H7 S.Typhimurium Domat (Zeytin Yaprağı Ham Ekstraktı) 1:1 (%10) 1:2 (%5) Edremit (Zeytin Yaprağı Ham Ekstraktı) 1:1 (%10) 1:2 (%5) Trilye (Zeytin Yaprağı Ham Ekstraktı) 1:1 (%10) 1:2 (%5) Domat (Kısmi Saflaştırılmış Oleuropein) 1:4 (%2,5) 1:8 (%1.25) Edremit (Kısmi Saflaştırılmış Oleuropein) 1:4 (%2,5) 1:16 (%0,625) Trilye (Kısmi Saflaştırılmış Oleuropein) 1:2 (%5) 1:8 (%1.25) Domat (Saflaştırılmış Oleuropein) 1:4 (%2,5) 1:8 (%1.25) Edremit (Saflaştırılmış Oleuropein) 1:2 (%5) 1:8 (%1.25) Trilye (Saflaştırılmış Oleuropein) 1:2 (%5) 1:8 (%1.25) Gökmen ve ark. [18] piyasadan temin ettikleri ticari zeytin yaprağı ekstraktının 10 bakteriye karşı (Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli O157, Salmonella Typhimurium) antimikrobiyal etkisini araştırmıştır. Antimikrobiyal aktivite disk difüzyon metodu ve mikrodilüsyon metodu ile belirlenmiştir. Araştırma sonucunda S. Typhimurium’a karşı zeytin yaprağı ekstraktının inhibisyon zon çapı 13.33±2.08, MİK değeri ≥16 mg/mL olarak tespit edilmiştir. E.coli ve E. coli O157 için inhibisyon zon çapları sırası ile 18.00±1.00; 17.67±0.58 olarak belirlenmiştir. MİK değerleri ise E.coli için ≥16 mg/mL, E.coli O157 için ≥32 mg/mL olarak tespit edilmiştir. Aliabadi ve ark. [19] zeytin yapraklarından su yardımı ile ekstrakt elde etmiş ve bu ekstraktın Staphylococcus aureus, Salmonella Typhimurium, E. coli, Klebsiella pneumonia ve Bacillus cereus’a karşı antimikrobiyal aktivitesini agar kuyu difüzyon metodu ile belirlemiştir. Zeytin yaprağı ekstraktının (50 mg/mL) en yüksek antimikrobiyal aktivitesini 11.5 mm inhibisyon zon çapı ile Salmonella Typhimurium’a karşı gösterdiği tespit edilmiştir. Liu ve ark. [15] konsantrasyonu 62.5 mg/mL olan zeytin yaprağı ekstraktının E. coli O157:H7 gıda kaynaklı bu patojenin büyümesini neredeyse tamamen inhibe ettiğini tespit etmiştir. Heidari-Soureshjani ve ark. [20] zeytin yağı, susam yağı ve bu iki yağın kombinasyonun E. coli üzerine antimikrobiyal etkisini broth mikro dilusyon yöntemiyle araştırmıştır. Zeytinyağı için MİK değeri 16 mg/mL belirlenirken, susam yağı için ise 64 mg/mL olarak belirlenmiştir. İki yağın karışımında ise MİK değeri yine 64 mg/mL olarak belirlenmiştir. Su ve metanol kullanılarak zeytin yaprağından elde edilen ekstraktın E. coli’ye karşı antimikrobiyal aktivitesinin araştırıldığı bir çalışmada; 50 mg/mL konsantrasyonunda metanolik ekstraktın E. coli’ye karşı 882 oluşturduğu inhibisyon zonu 10.5 mm olarak belirlenirken, sulu ekstraktın E. coli’ye karşı oluşturduğu inhibisyon zonu 5.0 mm olarak belirlenmiştir [21]. Dominciana ve ark. [22] tarafından oleuropein, ticari dezenfektan ve bu ikisinin kombinasyonunun E. coli için MİK değerleri araştırılmıştır. Bakteri süspansiyonu (108 kob/mL), oleuropein (0.4 mg/mL), perasetik asit ( % 2.0), benzalkonium klorit (%1.0), klorheksidin diglukonat (% 2.0), sodyum hipoklorit (% 2.0) ve hidrojen peroksit (% 3.0) solüsyonları kullanılmıştır. Oleuropein, paraasetik asit, benzalkonium klorit, klorheksidin diglukonat, sodyum hipoklorit ve hidrojen peroksit için MİK değerleri sırası ile 0.2; 0.312; 0.156; 0.312; 2.5; 0.234 olarak tespit edilmiştir. Ayrıca oleuropein ve ticari dezenfektanları kombinasyonunda ise bakterisidal etkinin arttığı tespit edilmiştir. 4.SONUÇ Çalışma sonucunda; zeytin yaprağı ekstraktı, kısmi saflaştırılmış oleuropein ve saflaştırılmış oleuropeinin E.coli O157:H7 ve S. Typhimurium’a karşı antimikrobiyal etkisinin bulunduğu tespit edilmiştir. Test edilen iki mikroorganizma için de kısmi saflaştırılmış oleuropein ve saflaştırılmış oleuropeinin antimikrobiyal aktivitesi, zeytin yaprağından elde ekstrakta göre daha etkin bulunmuştur. Salmonella Typhimurium’un E.coli O157:H7’ye nazaran zeytin yaprağından elde edilen bu ürünlere karşı daha duyarlı olduğu tespit edilmiştir. TEŞEKKÜR Bu çalışma, Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (GOÜ-BAP) Birimi tarafından 2017/98 nolu proje ile desteklenmiştir. Katkılarından dolayı GOÜ-BAP birimine teşekkür ederiz. KAYNAKLAR [1] Elgin-Cebe, G., Konyalıoğlu, S. ve Zeybek, U., Oleaeuropaea var. europaea (Zeytin) Yaprak İnfüzyonunun Antioksidan Etkisi, Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi 49 (3); 209-212, 2012. [2]Boskou, D., Olive oil chemistry and technology. History and characteristics of the olive tree. AOCS Press, Champaign, İllinois p:1 – 6, 1996. [3] Vogel, P., Kasper, Machado, I., Garavaglia, J., Zani, V.T., de Souza, D. and Morelo S.D.B., Polyphenols benefits of olive leaf (Olea europaea L) to human health, Nutricion Hospitalaria 31(3); 1427-1433, 2014. [4] Menduh, B., Zeytin, Zeytin Çekirdeği ve Zeytin Yaprağındaki Oleuropein Bileşiğinin İzolasyonu ve Miktarlarının Karşılaştırılması. (Yüksek Lisans Tezi), Balıkesir Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Balıkesir, 2015. [5] Talhaoui, N., Vezza, T., Gómez-Caravaca, A. M., Fernández-Gutiérrez, A., Gálvez, J. and Segura-Carretero, A., Phenolic compounds and in vitro immunomodulatory properties of three Andalusian olive leaf extracts, Journal of Functional Foods (22); 270-277, 2016. [6] Benavente-Garcia, O., Castillo, J., Lorente, J., Ortuno, A. and Del Rio, J. A., Antioxidant activity of phenolics extracted from Olea europaea L. Leaves, Food Chemistr, 68 (4); 457-462, 2000. [7] Korukluoğlu, M., Şahan, Y., Yiğit, A., Tümay-Özer, E. ve Gücer, Ş., Antibacterial activity and chemical constitutions of Olea europaea L. leaf extracts, Journal of Food Processing and Preservation (34); 383–396, 2010. [8]Jemai, H., El Feki, A. and Sayadi, S., Antidiabetic and antioxidant effects of hydroxytyrosol and oleuropein from olive leaves in alloxan-diabetic rats, Journal of Agricultural and Food Chemistry 57(19); 8798-8804, 2009. [9] Nekooeian, A.A., Khalili, A. and Khosravi, M.B., Oleuropein offers cardioprotection in rats with simultaneous type 2 diabetes and renal hypertension, Indian journal of pharmacology 46(4); 398, 2014. [10] Bouaziz, M. and Sayadi, S., Isolation and evaluation of antioxidants from leaves of a Tunisian cultivar olive tree, European Journal of Lipid Science and Technology 107(7‐8); 497-504, 2005. [11] Panizzi, L., Scarpati, M.L. and Oriente, G., Chemical structure of oleuropein, bitter glucoside of olive with hypotensive activity, Gazzetta Chimica Italiana (90); 1449-1485, 1960. [12]Iraqı, R., Vermeulen, C., Benzekrı, A., Bouseta, A. and Collin, S., Screening for Key Odorants in Moroccan Green Olives by Gas Chromatography-Olfactometry/Aroma Extract Dilution Analysis, Journal of Agricultural Food Chemistry (53); 1179-1184, 2005. [13] Omar, S.H., Cardioprotective and neuroprotective roles of oleuropein in olive, Saudi Pharmaceutical Journal (18); 111–121, 2010. 883 [14] Sanchez, J.C., Alsina, M.A., Herrlein, M.K. and Mestres, C., Interaction between the antibacterial compound, oleuropein, and model membranes, Colloid Polymer Science (285); 1351–1360, 2007. [15] Liu, Y., McKeever, L. C., & Malik, N. SAssessment of the antimicrobial activity of olive leaf extract against foodborne bacterial pathogens, Frontiers in microbiology 8, 113, 2017. [16]Omar, S.H., Oleuropein in Olive and its Pharmacological Effects, Scientia Pharmaceutica (78); 133–154, 2010. [17] Karabıyıklı, Ş. and Öncül N., Inhibitory effect of unripe grape products on foodborne pathogens, Journal of Food Processing and Preservation, 40(6); 1459-1465, 2016. [18] Gokmen, M., Kara, R., Akkaya, L., Torlak, E., & Onen, A., Evaluation of antimicrobial activity in olive (Olea europaea) leaf extract Am J Microbiol, 5(2); 37-40, 2014. [19]Aliabadi, M. A., Darsanaki, R. K., Rokhi, M. L., Nourbakhsh, M., & Raeisi, G., Antimicrobial activity of olive leaf aqueous extract Annals of Biological Research, 3(8); 4189-4191, 2012. [20] Heidari-Soureshjani, R., Gholipour, A., Obeidavi, Z., Jafari, A., Abbasi, S., & Madmoli, Y., Bactericidal and Bacteriostatic effect of sesame oil, olive oil and their synergism on Escherichia coli in vitro Advanced Herbal Medicine, 2016. [21]Dada, E. O., Antibacterial Activities of Olea europaea Leaf Extract on Some Bacteria Isolated from a Refused Dump Site in Akure, Nigeria, Journal of Biology 1(6); 118-124, 2013. [22]Dominciano, L. C. C., Oliveira, C. A. F., Lee, S. H., & Corassin, C. H., Individual and combined antimicrobial activity of oleuropein and chemical sanitizers, J Food Chem Nanotechnol 2(3); 124-127, 2016. 884 Effects of Oak Chips Addition on the Individual Phenolic Compounds of Grape Vinegar in Maturation Process M.Bayram1*, S. Topuz1, C. Kaya1 1Department of Food Engineering, Faculty of Natural Sciences and Engineering, Tokat Gaziosmanpaşa University, Tokat, Turkey Abstract In this study, it was aimed to investigate the effect of the addition of oak chips on the phenolic compound profile of grape vinegars. Total acidity, volatile acidty, non-volatile acidity, pH, dry extract, ash, colour, alcohol, total phenolic compound and individual phenolic compounds were analysed in vinegars. Total amount of phenolic compounds increased in the oak chips added vinegar in the study at the end of maturation process. Quinic acid was the highest individual phenolic compound in all vinegars. Catechin and gallic acid were the most present phenolic compounds respectively after quinic acid. The amount of gallic acid, catechin and vanillic acid were determined 8.43 mg/L, 22.26 mg/L, 1.78 mg/L in control samples respectively. At the end of the third month gallic acid, catechin and vanillic acid were determined 19.12 mg/L, 17.98 mg/L, 2.58 mg/L respectively in oak chips added vinegar. At the end of the maturation period, the amount of gallic acid and vanillic acid increased in oak chips added vinegar. Keywords: grape, vinegar, oak chips, phenolic compound 1.GİRİŞ Sirke, ilk aşamada fermente edilebilir şekerlerin mayalar (Saccharomyces spp.) tarafından etanole, daha sonra ise, etanolün asetik asit bakterileri (Acetobacter spp.) tarafından asetik asite dönüştürülmesi ile üretilmektedir [1]. Bilinen en eski sirke kullanımı 10.000 yıl öncesine dayanmaktadır. Sirke hemen hemen 5000 yıldır ticari bir ürün olarak üretilip satılmaktadır [2]. Sirke, bazı toplumlar tarafından eski çağlardan beri sulandırılarak serinletici bir içecek olarak tüketilmekte ayrıca salata sosları, ketçap, mayonez gibi gıda ürünlerinde lezzetlendirme ve muhafaza süresini arttırma amacıyla kullanılmaktadır. Son zamanlarda yapılan araştırmalarda, sirkenin antimikrobiyal, antioksidan [3], antidiyabetik [4], antikanserojenik [5], antihipertansif [6], antikolesterolemik [7], etkilere sahip olduğu tespit edilmiştir. Günlük yaşamımızda pek çok kullanım olanağı bulunan sirke ayrıca ekonomik açıdan ucuz bir üründür. Fakat balzamik sirke gibi yıllandırma işlemi gerektiren sirkeler, diğer sirkeler ile karşılaştırıldığında daha yüksek ekonomik değere sahiptir [8]. Tahta fıçılar, şarap ve diğer içecekleri olgunlaştırmak için yüzyıllardır kullanılmaktadır [9]. Kaliteli şarap sirkelerinin yıllandırma işlemi akasya, kiraz, kestane ve meşe ağacından yapılan fıçılarda gerçekleştirilmektedir [10]. Bunlar arasında kullanımı en yaygın olan ise meşe ağacından yapılan fıçılardır [11]. Meşe ağacından yapılan fıçıların ise başlıca iki kaynağı , Amerikan meşesi (Quercus alba) ve Fransız meşesi (Quercus robur veya Quercus petraea) dir. Bu iki türün kimyasal bileşimleri incelenmiş ve birbirinden farklı oldukları tespit edilmiştir [12]. Botanik olarak tür farklılığının yanı sıra coğrafi orijin, meşeden sirkeye geçebilecek bileşiklerin içeriği üzerine önemli bir etkide bulunmaktadır [13]. Meşe tahta dokusunun bileşimi % 40 selüloz, % 20 hemiselüloz, % 25 lignin, % 10 elajitanen, % 5 diğer (lipitler, steroller, uçucu bileşenler, mineraller) bileşiklerden oluşmaktadır [14]. Meşe dokusunda bulunan fenolik bileşikler üç ana gurupta incelenir; Bunlar uçucu fenoller, fenolik asitler ve aldehitler, tanenlerdir. Tanenler de kendi içerisinde hidrolize olabilen ve olmayan olmak üzere ikiye ayrılmaktadır [15]. Fıçıda olgunlaştırma süresi boyunca bir *Corresponding author. Tel.: +90 356-252-1616/2886: fax: +90 356-252-1729. E-mail address: [email protected] (M. Bayram). 885 kısım tanenler (gallotanenler, elajitanenlerin hidrolizi ile oluşan elajik ve gallik asitler), ligninin parçalanması sonucu oluşan fenolik asitler ve fenolik aldehitler, serbest fenolik asitler (vanilik, şirincik, ferulik asit); fıçının yakılması esnasında selülozun dönüşümü sonucu ortaya çıkan furfural ve hidroksimetilfurfural türü bileşikler fıçıdan ürüne geçer [14]. Meşe fıçılar yüzyıllar boyunca kullanılmasına rağmen bazı dezavantajlara da sahiptir. Birincisi meşe fıçıda olgunlaşma işlemi çok uzun zaman alan bir süreçtir. İkincisi fıçılar çok pahalıdır, çok fazla alan kaplamaktadır ve ayrıca zamanla değiştirilmesi gerekmektedir. Üçüncü olarak fıçılara zamanla Brettanomyces ve Dekkera gibi istenmeyen mikroorganizmalar kontamine olabilmektedir [16]. Ayrıca, fıçıların tekrar tekrar kullanılması ile fıçıdan geçebilecek bileşik miktarı zamanla azalmaktadır. Bu nedenle, olgunlaştırma işlemini kısaltan, maliyeti azaltan, ahşap kökenli fenolik ve aroma bileşiklerin geçişini sağlayan daha basit yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır [17]. Bu tekniklerden biri, yaygın olarak meşe yongası (chips) olarak bilinen küçük ahşap parçaların, paslanmaz çelik tanklarda veya fıçılarda bulunan şarap veya sirkeye üretimin farklı aşamalarında eklenmesiyle uygulanabilmektedir [17]. Meşe yongası hazırlamada meşe parçalarına ön işlem olarak suda kaynatma ve ısıl işlem uygulanmaktadır. Meşe yongalarına uygulanan ön işlem, meşe yongası boyutu ve miktarı meşeden sirkeye geçebilecek bileşiklerin çeşit ve miktarını etkilemektedir [18]. Bunların yanı sıra, olgunlaştırma işlemine tabi tutulan sıvı matriks geçebilecek bileşik çeşit ve miktarı üzerine önemli bir etkide bulunmaktadır [10]. Bu çalışmada olgunlaştırma aşamasında meşe yongası uygulamasının üzüm sirkesinin bireysel fenolik bileşikleri üzerine olan etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. 2.MATERYAL METOT 2.1. Materyal Araştırmada kullanılan Narince üzümünden üretilen üzüm sirkesi Özkaleli Gıda A.Ş.’den (Zile, Tokat) temin edilmiştir. Sirkenin olgunlaştırmasında kullanılan medium + seviyede kızartılmış olan meşe yongası (Fransız meşesi Quercus petrae ve Quercus robur) Pronektar Firmasından (Radoux, Fransa) temin edilmiştir. Sirkelerin fizikokimyasal analizleri Gaziosmanpaşa Üniversitesi Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Laboratuvarlarında yapılmıştır. 2.2. Metot Sirkeler 1 litrelik cam kavanozlara tepe boşluğu kalmayacak şekilde doldurulduktan sonra kavanozlara 10 g/L düzeyinde meşe yongası ilave edilmiştir. Kontrol grubu sirkeler ve meşe yongası ilave edilmiş sirkeler 22- 25 ̊C’de karanlık ortamda 3 ay boyunca depolanmıştır. Sirkelerde 0. ayda 1. ayda ve 3. ayda analizler gerçekleştirilmiştir. Üzüm sirkelerinin meşe yongası eklenmeden önce (0. Ay ) analizleri yapılmış ve genel özellikleri belirlenmiştir. Meşe yongası ilave edilmeyen kontrol örnekleri (S), meşe yongası ilave edilen örnekler ise (SM) olarak adlandırılmıştır. Çalışmada üretimler 3 tekerrürlü olarak gerçekleştirilmiştir. Sirkelerde yapılan analizler Bireysel Fenolik Bileşik Analizi Sirkede sinamik asitlerden; p-kumarik asit, ferulik asit, hidroksisinamik asit ve vanilik asit, benzoik asitlerden; gallik asit ve flavonollerden; kateşin ve kuersetin kantitatif olarak LC-MS-MS ile belirlenmiştir. a)Standartların hazırlanması Gallik asit, (+) kateşin, vanilik asit, p-kumarik asit, ferulik asit, hidroksisinnamik asit ve kuersetin standartları “Sigma-Aldrich” firmasından sağlanmıştır. Bütün standartlar için metil alkol kullanılarak stok çözeltiler hazırlanmıştır Standartlar -18 °C de saklanmıştır. b)Örneklerin hazırlanması Analizde kullanılan sirke örneklerinden 100 mL alınıp 0.22 μm’lik (Millex-HV) membran filtreden süzülmüştür. Filtratlar LC-MS-MS cihazı otomatik örnekleyici viallerine aktarılmıştır. LC-MS-MS koşulları Çizelge 1’de, gradient sistem çözücü konsantrasyonu Çizelge 2’de verilmiştir. 886 Çizelge. I. LC-MS koşulları HPLC koşulları Ekipman Shimadzu Degazör DGU-20A3R Pompa LC-30AD Otomatik Örnekleyici SIL-30AC Kolon Fırını CTO-10AS VP Kolon 3 μm , C18 (2.1mm x 150mm) Fırın Sıcaklığı 40°C Kütle Spektrometresi LCMS-8050 Mobil faz A 5mM Amonyumasetat Mobil faz B Metanol Akış Hızı (mL/dak) 0.4 Çizelge. II. LC-MS gradient sistem çözücü konsantrasyonu Süre (dak) A Konsantrasyon (%) B Konsantrasyon (%) 0 95 5 8 5 95 8-10.3 5 95 10.31 95 5 10.31-14 95 5 3.BULGULAR VE TARTIŞMA Sirkelerin bireysel fenolik bileşik miktarları (mg/L) Çizelge 3’te verilmiştir. S sirkesinde kuinik asit miktarı 0. Ayda 72.78 mg/L 1. ay sonunda 66.08 mg/L ve 3. ayda ise 68.14 mg/L olarak tespit edilmiştir. Meşe yongası ilave edilen SM sirkelerinde ise kuinik asit miktarı 1. ayda 66.84 mg/L, 3. ayda ise 69.23 mg/L olarak tespit edilmiştir. Çizelge. III. Sirkelerin bireysel fenolik bileşik miktarları (mg/L) 0.ay 1.ay 3.ay Fenolik bileşik S S SM S SM Kuinik Asit 72.78±8.04a 66.08±1.71a 66.84±0.66a 68.14±0.66a 69.23±0.32a Gallik Asit 6.40±0.13a 6.14±1.92a 9.77±0.65b 8.43±0.71b 19.12±0.72c Vanilik Asit 1.67±0.03a 1.70±0.05a 2.18±0.03b 1.78±0.006a 2.58±0.11c Kafeik Asit 2.02±0.05a 2.22±0.05a 1.94±0.15a 2.22±0.16a 2.02±0.01a p-kumarik asit 0.29±0.04a 0.32±0.03a 0.25±0.02a 0.32±0.03a 0.26±0.02a Ferulik Asit 0.26±0.02a 0.25±0.001a 0.30±0.06a 0.25±0.007a 0.31±0.002a Kateşin 19.03±0.29a 19.22±1.20a 17.28±0.09a 22.26±0.54b 17.98±0.48a Aynı satırdaki küçük harfler sirke örnekleri arasındaki istatistiksel farkı göstermektedir (P<0.05). S sirkesinde gallik asit miktarı 0. ayda 6.40 mg/L 1. ay sonunda 6.14 mg/L ve 3. ayda ise 8.43 mg/L olarak tespit edilmiştir. Meşe yongası ilave edilen SM sirkelerinde ise gallik asit miktarı artarak 1. ayda 9.77 mg/L, 3. ayda ise 19.12 mg/L olarak tespit edilmiştir. Meşe yongalı sirke örneği kromotogramı Şekil 1’de verilmiştir. S sirkelerinde kateşin miktarı 0. ayda 19.03 mg/L, 1. ayda 19.22 mg/L, 3. ayda 22.26 mg/L olarak belirlenmiştir. Meşe yongası ilave edilen SM sirkelerinin kateşin miktarı 1. ayda 17.28 mg/L ve 3. Ayda 17.98 mg/L olarak belirlenmiştir. S sirkelerinde vanilik asit miktarı 0. ayda 1.67 mg/L, 1. ayda 1.70 mg/L, 3. ayda 1.78 mg/L olarak belirlenmiştir. Meşe yongası ilave edilen SM sirkelerinin vanilik asit miktarında artış meydana gelmiş olup sirkelerin vanilik asit miktarı 1. ayda 2.18 mg/L ve 3. ayda 2.52 mg/L olarak saptanmıştır. Sirke örneklerinde 0. 1. ve 3. aylarda en yüksek miktarda belirlenen bireysel fenolik bileşik kuinik asit olmuştur. Kuinik asidi, kateşin ve gallik asit takip etmiştir. Sirke örneklerinde 3. ayda diğer aylardan farklı olarak kuinik asitten sonra en yüksek miktarda belirlenen bireysel fenolik bileşik gallik asit olmuştur. Genel olarak değerlendirildiğinde bireysel fenolik bileşiklerden gallik asit ve vanilik asit meşe yongası ilave edilen örneklerde 0. aya göre artmıştır. Gallik asit miktarındaki artışın oranı 1. ayda %52.65, 3. ayda %198.75 olarak belirlenmiştir. Vanilik asit miktarındaki artışın oranı 1. ayda %30.54, 3. ayda %54.49 olarak belirlenmiştir. Kontrol sirkesi ile SM sirkelerinin 1. ve 3. ay sonunda gallik ve vanilik asit miktarları arasındaki farklar istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). Kontrol sirkesi ile SM sirkelerinin 1. ve 3. ay sonundaki kuinik asit, kafeik asit, p-kumarik asit, ferulik asit miktarları arasındaki farklar ise istatistiksel olarak önemsiz olarak belirlenmiştir (P>0.05). 887 (x100,000) 1,75111:::QQQuuuiiinnniiiccc aaaccciiiddd T11I99C11(,,-22)00>>8942,,9500((--1/0/)) CCEE:: 2223,,00 777:::CCCaaattteeeccchhhiiinnn 22T88IC99(,,-22)00>>112539,,1100((--)) CCEE:: 2390,,00 2:Gallic acid TIC(-) 7:Catechin 289,20>109,10(-) CE: 26,0 1,502:Gallic acid 168,80>125,00(-) CE: 16,0 8:Quarcetin TIC(-) 2:Gallic acid 168,80>78,90(-) CE: 23,0 8:Quarcetin 300,80>151,10(-) CE: 21,0 3:Vanilik acid TIC(-) 8:Quarcetin 301,10>121,20(-) CE: 26,0 000011,,,,,,025702050505666655554444333:::::::::::::::FFFPPPPCCCCVVVFeee----eaaaaaaaCCCCrrrrffffnnnuuuueeeeooooiiillllllliiiiuuuuiiiiiiicccccccckkkmmmm aaaaaaaaaaaaaaacccccccccccrrrriiiiiiiiiiiiiiidddddddddddcccc 111T111T111aaaa777666II999ccccCC999766333iiii(dddd(,,,,,,,,,--232288 232))111T000000000666IC>>>>>>>>>333111111(181,,,-013205222093)1/0/9742820005,32,,,,,,>>>,,222901021191000000(00131-1/0/(((((((()7,9--------1/0/1 )))))))),,C 120 1/0/CCCCCCCCE00(EEEEEE-E:E(( )::::::--:2: )) C322111372 CC056587E8,80,,,,,,EE:,,000000 00::3 31015,2/0/0,,0099998:::::KKKKQ2/0/aaaaueeeeammmmrcppppeffffteeeeinrrrr oooo3llll 0222T3/0/0888I2/0/C,5558(1/0/,,,0-222)>0001>>>2/4/Cafeic acid01217815,7191,,,03121/0/4/0/(000-((()--- C))) ECCC:EEE 2:::3/5/P-Coumaric acid 9232,8080,,,0002/0/2/0/ 5/0/3/6/Ferulic acid 3/0/ 4/0/4/7/Catechin 5/0/ 5/0/ 1/8/Quarcetin 1/9/Kaempferol 2/0/ 3/0/ 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 min Şekil. I. Meşe yongalı sirke örneği LC-MS kromatogramı SM sirkelerinde kateşin miktarı 1. ve 3. ay sonunda kontrol sirkesine göre azalmıştır. Kontrol sirkesi ile SM sirkelerinin 1. ve 3. ay sonunda gallik asit miktarları arasındaki farklar istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). Kontrol sirkesi ile SM sirkelerinin 1. ve 3. ay sonunda vanilik asit miktarları arasındaki farklar da istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). 1. ay sonunda kontrol sirkesi ile sirke örneklerinin kateşin miktarları arasındaki fark istatistiksel olarak önemsiz (P>0.05), 3. ay sonundaki fark ise önemli olarak belirlenmiştir (P<0.05). Genel olarak değerlendirildiğinde fenolik asitlerden hidroksibenzoik asit grubunda yer alan gallik asit ve vanilik asit miktarı meşe yongası ilave edilen sirkelerde artarken hidroksisinnamik asitler grubunda yer alan p-kumarik asit, kafeik asit, ferulik asit gibi asitlerin miktarında istatistiksel olarak herhangi bir artış olmamıştır. Flavonoidlerin içerisinde yer alan flavan-3-ol grubundan kateşin miktarı meşe yongası ilave edilen örneklerde artmıştır. Kateşin ve epikateşin kombinasyonlarından oluşan proantosiyaninler sirke yapılacak şaraba maserasyon, presleme ve fermantasyon aşamalarında geçerler [19]. Gómez-Plaza ve ark., [20] farklı cibre fermantasyonu süresinin (4, 5 ve 10 gün) fenol bileşiklerinin çözünürlüğü üzerine etkisini araştırdıkları çalışmada, cibre fermantasyonu süresi uzun olan şaraplarda kateşin, prosiyanidin bileşiklerinin yüksek miktarda olduğunu olgunlaştırma aşaması ile birlikte polimer yapılı bileşik içeriğinin arttığını açıklamışlardır [19]. Bunun yanı sıra yongalara uygulanan ısıl işlemlerle lignin, selüloz ve elajitanenler gibi polimer fenoller, aldehitler, furfural türevleri ve laktonlar gibi bir çok bileşiğe parçalanırlar ve bu bileşikler olgunlaştırma süresince ürüne geçer [21]. Çalışmada olgunlaştırma aşamasının sonunda kateşin miktarındaki azalma bu bileşiklerin bazı bileşiklerle kondanse olmasıyla açıklanabilir. Gallik asit miktarındaki artış ise hidrolize edilebilir tanenlerin hidrolizi yoluyla gallik asit oluşumu ile açıklanabilir. Şarap ve sirkelerin meşe fıçılarda bekletilerek veya meşe yongası ilave edilerek olgunlaştırılmasında meşe ağacına has fenolik asitlerden birisi olan vanilik asit ürüne geçmiştir. Meşe fıçıların yaklaşık %20-25’ini lignin oluşturmaktadır. Sıvı gıdaların meşe yongası ile olgunlaştırılması esnasında ligninin parçalanması sonucu oluşan vanilik asit, siringaldehit gibi benzoik tip aldehitler ve konfiraldehit, sinapaldehit gibi sinnamik aldehitler ürüne geçmekte ve ürünün duyusal özelliklerinde önemli rol oynamaktadır. Tesfaye ve ark., [18] yaptıkları çalışmada %2 (g/mL) kaynatılmış, kızartılmış ve orta boy meşe yongası kullanarak Sherry şarap sirklerini 90 gün boyunca olgunlaştırmışlardır. İlk 15 günde bireysel fenolik bileşiklerden gallik asit ve vanilik asit miktarının hızlı bir şekilde arttığını tespit etmişlerdir. Kalan olgunlaştırma süresi boyunca gallik asit dışında diğer fenolik bileşik miktarlarında artış gözlemlenmemiştir. Çalışmada Sherry şarap sirkelerinin meşe yongası ile olgunlaştırılmasında 15 günlük sürenin fenolik bileşiklerin üründe istenen seviyeye gelmesi için uygun olduğu belirtilmiştir. Cerezo ve ark., [22] yaptıkları çalışmada farklı odun fıçıların olgunlaştırma aşamasında sirke kalitesini nasıl etkilediğini belirlemeyi amaçlamışlardır. Bu nedenle sirkeyi; akasya, kiraz, kestane ve meşe ağacından yapılmış fıçılarda olgunlaştırmaya bırakmışlardır. Balsamik ve kırmızı şarap sirkeleri olmak üzere iki çeşit sirkeyi incelemişlerdir. Meşe fıçılarla olgunlaştırma sonunda 2-furfuraldehid, protokateşialdehit ve vanilik asit konsantrasyonunun önemli ölçüde arttığını belirlemişlerdir. Çalışmada belirlenen sonuçlar Cerezo ve ark [22]yaptıkları çalışma ile uyum içerisindedir. Cerezo ve ark., [10] ahşap talaşının, olgunlaşma süresini azaltmak için sirke yapımında yaygın olarak kullanıldığını belirtmişlerdir. Yaptıkları çalışmada farklı ağaç türlerinden (akasya, kiraz, kestane ve meşe) elde edilen talaşların olgunlaşma sürecinde sirkenin fenolik bileşikleri üzerine etkisini belirlemeyi amaçlamışlardır. Çalışmada ısıl işlem görmüş ve görmemiş talaşlar sirkelere iki farklı oranda [% 0.5 ve % 1 (w/v)] uygulanmış ve sirkeler 15 - 30 gün olgunlaştırma işlemine tabi tutulmuştur. Sonuç olarak, naringenin ve kaempferol (kiraz), robinetin ve fustin (akasya) ve isovanillin (meşe) gibi ahşap işaretleyicileri ilk defa sirkede tanımlamışlardır. Dikkate değer şekilde, sirke içinde en çok polifenol bileşiğinin en yüksek artışlarını elde etmek için 15 günlük olgunlaştırma süresinin yeterli olduğunu bildirmişlerdir. 888 4. SONUÇ Sirkelerin fenolik bileşik miktarı ve kompozisyonu hammadde ve üretim yönteminden etkilenmektedir. Bu çalışmada meşe yongası ilave edilen sirkede toplam fenolik bileşik miktarı artmıştır. Bireysel fenolik bileşikler içerisinde en fazla miktarda kuinik asit bulunduğu belirlenmiş olup meşe yongası ilave edilen sirkelerde olgunlaştırma süresi sonunda miktarı artan fenolik bileşenlerin gallik asit ve vanilik asit olduğu tespit edilmiştir. Sirkede gallik asit ve vanilik asit miktarında artış gözlenmesi meşe yongasından sirkeye fenolik bileşik geçişi olduğunun göstergesidir. Sirkeye farklı oranlarda fenolik bileşik geçişi yonga boyutu, meşe ağacının botanik menşei, coğrafi köken, kızartma türü, kullanım dozajı gibi faktörlerden etkilenebilmektedir. Meşe odunu bileşiminde bulunan fenolik bileşiklerin sirkeye geçişi sirke kalitesini artırmaktadır. Geleneksel olarak uygulanan meşe fıçıda olgunlaştırma prosesine alternatif meşe yongası kullanımı işlem süresini kısaltması, maliyeti düşürmesi ve işlem kolaylığı dikkate alındığında, hem işletmelerin rekabet gücünü artıracak hem de tüketicilerin daha kaliteli ve daha sağlıklı ürünlere daha uygun fiyatlarla ulaşabilmesini sağlayacaktır. Meşe yongası ilavesi ile fenolik bileşikler açısından zengin sirkelerin daha hızlı ve ekonomik bir şekilde üretiminin gerçekleştirilebileceği görülmüştür. Ayrıca ileriki çalışmalarda farklı konsantrasyonlarda meşe yongası ilavesinin ve başka ağaç türlerinden (akasya, kestane vb.) elde edilen yongaların sirke üzerine olan etkilerinin incelenmesiyle konuya ilişkin daha detaylı bulgular elde edilmesi ve ticari üretim yapan işletmelere alternatif ürünler üretebilmelerine yönelik önemli sonuçlar elde edilebileceği düşünülmektedir. ACKNOWLEDGMENT Bu çalışma, Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (GOÜ-BAP) Birimi tarafından 2017/109 nolu proje ile desteklenmiştir. Katkılarından dolayı GOÜ-BAP birimine teşekkür ederiz. REFERENCES [1] De Leonardis, A., Macciola, V., Lorizzo, M., Lombardi, S.J., Francesco Lopez and Marconi E., Effective assay for olive vinegar production from olive oil mill waste waters, Food Chemistry 240; 437-440, 2018. [2] Budak, H.N., Güzel-Seydim, Z.B., Sirke üretimi ve bazı fonksiyonel özellikleri, http://www.gidateknolojisi.com.tr/haber/2012/10/sirke-üretimi-ve-bazı-fonksiyonel özellikleri, 2012. [3] Budak, H.B., Guzel Seydim, Z.B., Antioxidant activity and phenolic content of wine vinegars produced by two different techniques. Journal of Food Science and Food Agriculture 90:2021–2026, 2010. [4] Yusoof, N.A., Yon, M.F., Beh, H.K., Razak, K.N.A., Widyawati, T., Mahmud, R., Ahmad, M., Asmawi, M.Z., Antidiabetic and antioxidant activities of Nypa fruticans Wurmb. Vinegar sample from Malaysia, Asian Pasific Journal of tropical medicine 8(8); 595-605, 2015. [5] Nanda, K., Miyoshi, N., Nakamura, Y., Shimoji, Y., Tamura, Y., Nishikawa, Y., Uenakai, K., Kohno, H., Tanaka, T., Extract of vinegar “Kurosu” from unpolished rice inhibits the proliferation of human cancer cells. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 23; 69-75, 2004. [6] Kondo, S., Tayama, K., Tsukamoto, Y., Ikeda, K., Yamori, Y., Antihypertensive Effects of Acetic acid and Vinegar on Spontaneously Hypertensive Rats. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 65; 2690-2694, 2001. [7] Fushimi, T., Suruga, K., Oshima, Y., Fukiharu, M., Tsukamoto, Y., Goda, T., Dietary acetic acid reduces serum cholesterol and triacyl glycerols in rats fed a cholesterol-rich diet. British Journal of Nutrition 95; 916-924, 2006. [8] Pinu, F.R., Carvalho-Silva, S., Trovatti Uetanabaro A.P., Villas-Boas., S.G., Vinegar metabolomisc: An Explorative Study of Commercial Balsamic Vinegars Using Gas Chromatography-Mass Spectrometry. Metabolites 6(3), 22. [9] Waterhouse, A.L., ve Towey, J.P., Oak lactone isomer ratio distinguishes between wines fermented in American and French oak barrels. Journal of Agriculture and Food Chemistry 42, 1971–1974. [10] Cerezo, A.B., Fernandez, A.A., Ortega, R., Troncoso, A.M., Parilla, M.C., Phenolic Composition of Vinegarsover an Accelerated Aging Process Using Different Wood Species Área de Nutricióny Bromatología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, Spain. 62(19); 4369–4376, 2014. [11] Perez-Coello, M. S., Sanz, J., & Cabezudo, M. D., 1997. Analysis of volatile components of oak wood by solvent extraction and thermal desorption–gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A 778, 427– 434. [12] Singleton, V.L., Maturation of wines and spirits: comparison, facts and hypotheses. Am. J. Enol. Vitic 46; 98-115, 1995. [13] Prida A, Puech J.L., Influence of geographical origin and botanical species on the content of extractives in American, French, and East European oak woods. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2006 Oct 18;54(21);8115-8126, 2006. [14] Anlı R.E., Meşe Fıçıların Özellikleri Ve Şarabın Yıllanmasındaki Önemi. Gıda 24(6); 379-383, 1999. 889