Facultade de Ciencias  Departamento de Bioloxía Animal, Bioloxía Vexetal e Ecoloxía  Área de Botánica       Estudios de Biología Reproductiva en el género Anthoxanthum  L. (Poaceae)    Estudos de Bioloxía Reprodutiva no xénero Anthoxanthum L.  (Poaceae)    Reproductive Biology studies in genus Anthoxanthum L.  (Poaceae)              Sofía Salutregui Darriba  Trabajo de Fin de Grado  29/07/2015    Tutores: Dr Manuel Pimentel Pereira y Elvira Sahuquillo Balbuena. TRABALLO DE FIN DE GRAO Manuel Pimentel Pereira E Elvira Sahuquillo Balbuena autorizan a presentación do Traballo de Fin de Grao “Estudios de Biología Reproductiva en el género Anthoxanthum L. (Poaceae)” presentado por Sofía Salutregui Darriba para a súa defensa ante o tribunal cualificador. En A Coruña, a 22 de xullo de 2015 Asdo.: Dr. Manuel Pimentel Asdo.: Dra. Elvira Sahuquillo RESUMEN En este estudio se ha llevado a cabo el análisis micro-morfológico de la anatomía foliar de Anthoxanthum aristatum (2x) y A. odoratum (4x). Asimismo, se ha analizado un parámetro esencial de la biología reproductiva, la viabilidad polínica. El objetivo general del trabajo fue conocer cómo afecta el nivel de ploidía a los parámetros analizados. En total, seis poblaciones del NW de la Península Ibérica fueron estudiadas. Se tomaron medidas anatómicas de la superficie abaxial de la epidermis en 15 individuos por población. Asimismo, se hizo un examen de la viabilidad del polen mediante el empleo de Diacetato de Fluoresceína (FDA), técnica cuya utilidad está condicionada a que las anteras se encuentren en el estadio de maduración adecuado. Los resultados micro-morfológicos obtenidos permiten diferenciar los niveles de ploidía en base a los caracteres estudiados, presentando el tetraploide valores más altos. Los resultados del test de viabilidad polínica muestran un aumento de la misma en la especie diploide con respecto a su pariente tetraploide. Este resultado obtenido para Anthoxanthum L. es coherente con lo observado en la literatura. ABSTRACT Both the micro-morphology and the pollen viability (essential in a plant reproductive biology) of two species in the Anthoxanthum polyploid complex have been assessed in this study. More particularly, the taxa A. aristatum (2x) and A. odoratum (4x) have been chosen for this research project. Our main aim was to understand they way in which ploidy level affects the analysed parameters. Overall, six populations from NW Iberian Peninsula were considered. Micro-morphological traits from the abaxial epidermal surface were measured in 15 specimens per population. Moreover, pollen viability was assessed through the use of FDA staining; a method suitable for Anthoxanthum provided that the anthers are at the right developmental stage. The obtained data were analysed through descriptive statistics and different tests of data variation and dispersal. Our micro-morphological results alowed us to differentiate between the different species (and ploidy levels), with the tetraploid taxon showing higher values. The results of the pollen viability analysis showed and increase in the diploid species with respect to the tetraploid taxon. This result is consistent with what has been found in the literature. ÍNDICE   1. INTRODUCCIÓN........................................................................................................2 1.1. Características del género y de las especies analizadas.........................................2 1.2. Anatomía foliar del género Anthoxanthum............................................................4 1.3. Importancia de la poliploidía en evolución vegetal...............................................5 2. OBJETIVOS.................................................................................................................6 3. MATERIAL Y MÉTODOS.........................................................................................7 3.1. Recogida y análisis de muestras campo y laboratorio...........................................7 3.2. Estudio anatómico..................................................................................................8 3.3. Estudio de la viabilidad polínica............................................................................8 3.4. Tratamiento de datos............................................................................................10 4. RESULTADOS..........................................................................................................11 4.1. Estudio anatómico................................................................................................11 4.2. Viabilidad polínica...............................................................................................17 5. DISCUSIÓN...............................................................................................................20 6. CONCLUSIONES......................................................................................................23 7. BIBLIOGRAFÍA........................................................................................................24   1 1. INTRODUCCIÓN Anthoxanthum L. s. str. (Poaceae; Pooideae) es un género de plantas vasculares que incluye aproximadamente 22 especies (Watson & Dallwitz, 1992; Soreng & Davis, 2000) anuales y perennes de morfología muy similar. Las especies que conforman el género crecen en zonas templadas y ártico-alpinas de Europa, Asia y África (Clayton & Renvoize, 1986; Watson & Dallwitz, 1992; Drapikowska et al., 2013), aunque Anthoxanthum odoratum ha sido introducida tanto en América como en Australia (Mack, 2000). Junto con los géneros Hierochloë R.Br. y Phalaris L., las especies del género Anthoxanthum han sido tradicionalmente incluidas dentro de la tribu Phalarideae (Soreng & Davis, 2000). Los miembros de la tribu presentan en común que sus espiguillas están formadas por tres flores, y éstas están además lateralmente comprimidas (Soreng et al., 2009). De estas tres flores, la superior es hermafrodita, mientras que las dos inferiores presentan sus piezas florales reducidas a diferentes niveles (Schouten & Veldkamp, 1985). En Anthoxanthum, las flores inferiores son estériles, pudiendo estar reducidas a lemas. 1.1. Características del género y de las especies analizadas Las especies que se van a tratar en el presente trabajo pertenecen a Anthoxanthum sección Anthoxanthum, que comprende de nueve a diez especies anuales y perennes, las cuales muestran una gran variabilidad, tanto en niveles de ploidía como en morfología (Pimentel et al., 2007). Esta sección está distribuida mayoritariamente en regiones templadas y ártico-alpinas del norte de Eurasia, el Mediterráneo, Macaronesia y este de África. Se trata de plantas herbáceas caracterizadas por tener las hojas envainantes y planas, con lígulas membranosas, truncadas o en punta, pero nunca reducidas a una línea de pelos (Tutin, 1980). Plantas glabras o pilosas, con inflorescencias en forma de panícula condensada. La inflorescencia porta numerosas espiguillas (Figura 1) lateralmente comprimidas, con una sola flor fértil y dos flores estériles inferiores reducidas a los lemas, de mayor tamaño que la flor fértil y pubescentes con el dorso aristado. Las glumas son desiguales: la inferior es más corta y uninervia, y la superior es más larga que las flores y trinervada. Los lemas y páleas presentan diferencias entre las flores fértiles y las dos estériles: en las fértiles son pequeñas, membranosas y glabras,   2 mientras que en las estériles son pilosas y aristadas. En ambos casos, el lema superior tiene una gran arista. La flor fértil no tiene lodículas. La cariópside es glabra, brillante y oval. Figura 1. Inflorescencia y espiguilla de Anthoxanthum. Autor: David Romero. En el presente estudio trabajaremos sobre dos taxa, diferentes según su nivel de ploidía. El tetraploide Anthoxanthum odoratum L. (2n=20), también conocido como “grama de olor”, es una hierba tremendamente variable que aparece como perenne en pastos, aunque en algunas localidades se ha visto en zonas húmedas o bosques. La especie muestra una gran adaptabilidad, pudiendo llegar a colonizar una gran cantidad de hábitats. Anthoxanthum aristatum Boiss. se trata de una especie anual y diploide (2n = 10), propia de zonas costeras y a menudo rocosas (también presente en zonas de poco suelo en el interior), distribuyéndose a lo largo de la Cuenca Mediterránea, áreas Atlánticas del Sur de Europa y Norte de África (Pimentel et al., 2007). Los estudios morfológicos entre Anthoxanthum aristatum y Anthoxanthum odoratum revelaron que existen diferencias significativas entre las dos especies (e.g. Drapikowska et al., 2008), pero ocasionalmente los rasgos de ambas especies pueden solaparse, dificultando así su identificación. Anthoxanthum odoratum (Figura 2.A.) se diferencia por ser una planta cespitosa perenne que no presenta raíces tuberosas en la base, por poseer una anchura de las hojas de entre 2 y 8 mm, por el tamaño de sus espiguillas (7 – 9 mm) y por el grado de pubescencia en las lemas de las flores estériles que tienen,   3 además, una arista geniculada. A. aristatum (Figura 2.B.) puede ser glabra o poco pilosa, con hojas de hasta 5 mm de anchura y con espiguillas de hasta 5 mm de longitud. En general, su porte es inferior al de A.odoratum. La lema superior estéril presenta una arista que supera con creces la espiguilla, y siendo la flor fértil de un tamaño más reducido que las estériles (Paunero, 1953). Figura 2. A. Anthoxanthum odoratum L., tomado de science.halleyhosting.com; B. Anthoxanthum aristatum Boiss., tomado de blumeninschwaben.de. 1.2. Anatomía foliar del género Anthoxanthum En general, la estructura de las hojas en las gramíneas tiene escasa importancia taxonómica (salvo por características relacionadas con la vaina y la lígula), sin embargo, se ha puesto de manifiesto el valor de ciertos caracteres anatómicos (Brown, 1958) relativos a la epidermis tanto adaxial como abaxial, siendo esta última la más empleada por su facilidad de extracción (Devesa, 1992). Los caracteres de uso más habitual serán la longitud y tipología de las células largas y cortas y las dimensiones de los estomas (Devesa, 1992; Drapikowska et al. 2013). En el género Anthoxanthum se han observado correlaciones entre estos caracteres y el nivel de ploidía (Pimentel & Sahuquillo, 2003; Drapikowska et al. 2013).   4 1.3. Importancia de la poliploidía en evolución vegetal. La poliploidía consiste en la posesión de más de dos juegos de cromosomas por cada núcleo (Soltis & Soltis, 1999), y está considerada como una de las mayores fuerzas que operan en la evolución de las plantas, afectando tanto a la diversificación como a la especiación (Otto & Whitton, 2000; Adams & Wendel, 2005; Soltis et al., 2009). Las duplicaciones completas del genoma causan en las plantas cambios genéticos que conducen a la diferenciación genética, fisiológica y morfológica, dando como resultado nuevos fenotipos (Adams & Wendel, 2005). En términos de especiación y diversificación, el rol de la poliploidía en angiospermas es todavía controvertido (Stebbins, 1950). Estudios recientes destacan el potencial de los poliploides en la evolución, pues el elevado número de alelos aporta: (i) enmascaramiento de mutaciones deletéreas recesivas, (ii) heterosis estable y (iii) el potencial de los genes duplicados de adquirir nuevas y variadas funciones (Wendel, 2000; Adams & Wendel, 2005). Por otra parte, también es considerado como un factor importante en la distribución y ecología de las especies (Soltis & Soltis, 2012). Mantener la reproducción sexual en estos nuevos genotipos podría ser arriesgado, pues podrían entrecruzarse con sus progenitores. Además, se podrían formar frecuentemente irregularidades cromosómicas, llevando a la producción de gametos no viables (Hardion et al., 2015). Aunque la poliploidía está muy extendida en el reino vegetal, su frecuencia y nivel varían dependiendo del grupo taxonómico (Husband et al., 2013). Dentro de las angiospermas, se da más frecuentemente en monocotiledóneas que en dicotiledóneas (Otto & Whitton, 2000). Es especialmente abundante entre las gramíneas, siendo por ejemplo el género Anthoxanthum un interesante representante de complejo poliploide (Hedberg, 1986).   5 2. OBJETIVOS En el presente estudio se explora la relación entre distintos caracteres anatómicos y biológicos y el nivel de ploidía (i.e. la taxonomía) en poblaciones del NW ibérico del complejo poliploide A. odoratum/A. aristatum. Objetivos específicos de este trabajo serán: 1. Correlacionar la variabilidad de tres caracteres anatómico-foliares de uso habitual en la taxonomía de las gramíneas con el nivel de ploidía en especies del complejo poliploide de Anthoxanthum. 2. Correlacionar la viabilidad polínica en dos especies del género Anthoxanthum que presentan diferentes niveles de ploidía.                         6 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. Recogida y análisis de muestras: campo y laboratorio Para la realización de los objetivos expuestos anteriormente, se seleccionaron 6 poblaciones (Tabla 1) en el NW de la Península Ibérica: tres de Anthoxanthum aristatum, y tres de A. odoratum. La unidad de estudio fue la población porque, según Tyteca & Gathoye (1988), la información que se obtiene mediante ejemplares recogidos individualmente es poco significativa. Dada la capacidad para la reproducción asexual de A. odoratum, las muestras se recogieron separadas 1 m. Para su transporte, se almacenaron en bolsas individuales, manteniendo las raíces húmedas envolviéndolas con papel mojado. Ya en el laboratorio las plantas se identificaron según los trabajos de Paunero (1953) y Valdés (1973). En un primer momento, las plantas colectadas se mantuvieron en bandejas con perlita regadas con agua y abono general al 0,05%, lo que permitió la puesta a punto de los métodos. Posteriormente, las plantas recolectadas eran procesadas directamente. Tabla 1. Poblaciones estudiadas. La fecha indicada hace referencia al día en que el material fue recogido del campo. NA: número de ejemplares utilizados para evaluar los caracteres anatómicos. NP: número de ejemplares utilizados para evaluar la viabilidad del polen. Especie Ploidía Localidad Provincia Fecha NA NP Dexo, A. aristatum 2x A Coruña 23/03/2015 15 5 Oleiros Sequeiros, A. aristatum 2x Lugo 15/04/2015 15 5 Quiroga Cabo A. aristatum 2x Silleiro, Sta Pontevedra 15/04/2015 0 5 María de Oia Arillo, A. odoratum 4x A Coruña 23/03/2015 15 5 Oleiros A. odoratum 4x Sarria Lugo 02/05/2015 15 5 A. odoratum 4x A Zapateira A Coruña 22/07/2015 15 5   7