UNIVERSITE DE BOURGOGNE U.F.R DE MEDECINE Année 2013 N° attribué par la bibliothèque : THESE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE BOURGOGNE DISCIPLINE : SCIENCES DE LA VIE SPECIALITE : BIOCHIMIE, BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE PRESENTEE ET SOUTENUE PUBLIQUEMENT LE 28 OCTOBRE 2013 PAR MYRIAM LAMRANI ETUDE DE L’EFFET ANTITUMORAL DE L’ACTIVATION DE LA NO- SYNTHASE INDUCTIBLE DANS UN MODELE DE CANCER DU SEIN : ANALYSE DES MECANISMES MOLECULAIRES Directeur de thèse : ALI BETTAIEB MEMBRES DU JURY : Dr. Fawzia LOUACHE Rapporteur Dr. Fabrice COGNASSE Rapporteur Dr. Isabelle COSTE Examinateur Dr. Dominique DELMAS Examinateur Pr. Ali BETTAIEB Directeur de thèse Je dédie cette thèse à mes parents, 2 Remerciements Je remercie vivement les membres du jury, examinateurs et rapporteurs, pour me faire l’honneur de juger mon travail. Merci aux docteurs Fawzia Louache et Fabrice Cognasse pour avoir accepté de juger mon travail de thèse. Je remercie les docteurs Isabelle Coste et Dominique Delmas pour avoir accepté de faire partie de ce jury. Je tiens tout d’abord à remercier monsieur Eric Solary, ex-directeur du Centre de Recherche Inserm (CRI) U866 et monsieur Laurent Lagrost, pour m’avoir accueillie au sein de cette unité. Merci à Ali Bettaieb, directeur d’étude à l’EPHE, et mon directeur de thèse. Tu es un peu comme mon papa scientifique, je te remercie d’abord pour m’avoir soutenu et pour m’avoir encouragé à continuer en thèse. Merci pour tous tes conseils et toutes les idées de manipulation que tu m’as suggéré. Merci pour ta gentillesse, ton humour, ta disponibilité et tes petites tapes affectives qui parfois me laissent des traces rouges sur l’épaule (elles vont beaucoup me manquer). Cette thèse c’est grâce à toi en partie si elle s’est bien passé, tu m’as donné des responsabilités, tu m’a surtout fais confiance et j’espère que tu ne t’en mords pas les doigts aujourd’hui ! Je remercie particulièrement Jean-François Jeannin, directeur d’étude à l’Ecole Pratique des Hautes Etudes, pour m’avoir permis de suivre mon master au sein de son équipe. Je le remercie pour m’avoir fait confiance dans mes travaux et permis de conforter mon gout pour la recherche. Merci à Catherine Paul, maitre de conférences à l’EPHE. Notre histoire a commencé en master, et oui souviens toi tu étais ma tutrice scientifique. Je te remercie pour m’avoir encadrée pendant ces deux années de master et avoir continué avec moi sur le projet lipide A pendant ma thèse. Merci pour ta patience, ton écoute et pour avoir pris le temps de répondre à mes questions. Merci pour tous tes sourires, ton humour et ta gentillesse. Je tiens à remercier Néjia Sassi, ancienne doctorante de notre équipe, pour m’avoir formé à la plus grande partie des techniques que j’utilise aujourd’hui. Merci pour tous tes conseils qui me sont toujours très utile. Merci à Jérôme Labbé, notre ancien « technicien de recherche de luxe », pour sa bonne humeur et pour ses compétences multiples. Il a vite été remplacé par une nouvelle technicienne, Cindy Racoeur-Godard. Merci à toi pour ton aide en in vivo, pour ta gentillesse, ta bonne humeur et surtout ta diplomatie. On a passé pas mal d’heures à l’animalerie, pas mal de week-end aussi, c’était vraiment agréable de travailler avec toi. 3 Je remercie chaleureusement Lissbeth, pour tous les bons moments passé ensemble à mettre au point la technique du « Biotine Switch Assay », mais surtout pour les pauses Mc DO afin de décompresser après un BSA! Merci pour ta gentillesse, ta sympathie et ton amitié. Ton départ du labo m’a laissé un vide mais heureusement le turnover était efficace et la venue de Sabrina est venue combler un peu tout ça. Merci à Sabrina, d’une pour ta venue et de deux parce que je te kiff ! (c’est ton expression favorite en ce moment). Merci pour l’aide que tu m’as apporté sur le projet Ubc, je sais que ce n’est pas toujours facile, mais tu es une warrior ! Merci aussi pour tes talents de mise en page, qui m’ont été utile en cette fin de thèse et merci pour ton amitié qui je pense va durer. Je te kiff ! Je remercie ma petite Léa, pour ta voix si douce et ton vocabulaire si… Merci pour ta bonne humeur et ta gentillesse. Rahamata, merci pour tout, pour tes conseils, pour ta sympathie et ton franc parler bien direct (un peu comme moi!). Carla, tu es toute nouvelle au labo, mais je t’aime bien, t’es rigolote ! Merci pour tes corrections de français pendant la rédaction de mon manuscrit. Merci à tous les membres de l’équipe « NO et Cancer », les anciens et nouveaux : Véronique, Stéphanie, Olivier, Kumar, Alessandra, Nicolas, Fouzia, Rahamata, , Hanaa, Nabil, la petite Amandine, , Maria (la petite nouvelle). Je les remercie pour leur sympathie, leur aide et leur bonne humeur générale. Je remercie toutes les personnes qui ont apporté leur aide pour le déroulement de mon projet de thèse. Merci à Jean-Luc Boucher (paris Descartes) pour son aide en chimie du NO, je le remercie pour tous ces conseils en RPE et surtout pour ces compétences. Merci également à Monsieur Luc Rochette pour ses conseils et compétences sur le stress oxydatif. Merci à tous les membres de l’animalerie, à ceux de la plateforme de cytométrie en flux, à ceux de la plateforme de protéomique Merci à Naïma Benikhlef, Malika Trad, Aziza Aznague, Sébastien Morel, Mélanie Bruchard, Jessica Gobbo et le trio Ahmed Habbout, Arthur Marivin (allias Atchoum), Jean Berthelet (allias Juan Carlos de la Vega) pour leur amitié. Je tiens à adresser mes remerciement à tous les membres de l’U866 (anciens et nouveaux) qui ont, chacun, imprégnés ma thèse à leur manière. Car une thèse prend aussi toute sa richesse et don sens dans l’entraide et la communication. 4 Merci à mes frères, Farid (j’ai puisé en toi mon goût pour les sciences), Rachid (j’admire ta culture, ta curiosité et ton intelligence), Youness (si tout le monde était comme toi le monde irait beaucoup mieux), Hakim (mon jumeau, avoue que tu ne peux pas te passer de Myriam !) et Ismaël (mon petit dernier très affectif), et ma sœur Nadia (t’es non seulement ma sœur, mais aussi ma confidente, ma meilleure amie). Je les remercie pour leurs soutiens inconditionnel, leurs encouragements, leur affection et surtout leur patience pour toute ces années passées à mes coté. Merci à Karim, pour ta patience, ton affection et maintenant à ton tour de me subir ! Je tiens finalement mais surtout à remercier ma mère et mon père pour avoir donné un sens à ma thèse. Si j’ai pu rester motivé jusqu’au bout c’est grâce à vous et pour vous. Je vous dois tous, la meilleure des reconnaissances à mes yeux c’est la vôtre. Merci pour m’avoir toujours encouragé et guider pour atteindre mes objectifs. Je les remercie pour leur soutien sans faille et leur affection. Merci pour votre force qui m’a toujours fait avancer, merci pour tous les sacrifices que vous faite pour nous chaque jours. 5 Résumé L’effet anti-tumoral d'un lipide A, l’OM-174 (partie lipidique des lipopolysaccharides) a été étudié dans un modèle de cancer mammaire chez la souris. In vivo, l’OM-174 augmente la survie de la souris alors qu’in vitro il n'est pas toxique pour les cellules cancéreuses. L’OM-174 se lie au récepteur TLR4 des cellules immunitaires induisant la production de cytokines comme l’IFN . In vitro, l’association de cette cytokine au lipide A est cytotoxique. L’objectif de cette thèse est d’en analyser les mécanismes moléculaires. Nous avons montré, aussi bien in vitro qu’in vivo, que la cytotoxicité du lipide A/IFN est dépendante du TLR4, du récepteur à l’IFN et de l’expression de la NOS II. Nous avons également montré que les espèces radicalaires, NO et anion superoxyde formant le peroxynitrite jouent un rôle crucial dans cette cytotoxicité. L’origine de ces espèces radicalaires se trouve être la NOS II selon un processus de découplage enzymatique. Nous avons également cherché d’autres mécanismes associés pouvant expliquer la cytotoxicité du lipide A/IFN . Nous avons ensuite montré que le NO est capable de réagir avec les résidus cystéine de certaines protéines, un processus appelé S- nitrosylation. Une analyse protéomique nous a permis d’identifier au moins une dizaine de protéines qui sont S-nitrosylées dans les cellules cancéreuses mammaires en réponse au lipide A/IFN . Nous avons étudié l’impact de cette modification sur la fonction d’une des ces protéines, l’enzyme de conjugaison E2 de l’ubiquitine Ubc13, une protéine impliquée dans la prolifération et la survie cellulaire. Nous avons confirmé la nitrosylation d’Ubc13 et identifié la cystéine 87 comme cible du NO. L’expression d’une forme mutée d’Ubc13 (remplacement de la cystéine 87 par une alanine) inhibe l’auto-ubiquitination de l’enzyme et sa capacité à ubiquitiner une de ses cibles I B . Nous avons montré que la S-nitrosylation d’Ubc13 induit sa migration vers le noyau et rend les cellules plus sensibles à l’effet cytotoxique du lipide A/IFN . En résumé, nos résultats révèlent un rôle majeur et insoupçonné de la NOS II et du NO dans l’effet antitumoral du lipide A OM-174 dans un modèle de cancer mammaire chez la souris ouvrant la voie pour la conception de nouveaux traitements anticancéreux. Mots clés: TLR4, monoxyde d’azote, NOS II, lipide A, S-nitrosylation, Ubc13, effet anti-tumoral 6 Abstract The anti -tumor effect of a lipid A, OM -174 (lipid portion of LPS) was studied in a model of breast cancer in mice. In vivo, OM- 174 increases the survival of mice whereas in vitro it is not toxic to cancer cells. OM -174 binds to TLR4 immune cells inducing the production of cytokines such as IFN . In vitro, the combination of IFN to lipid A is cytotoxic. The objective of this thesis is to analyze those molecular mechanisms. We have shown both in vitro and in vivo that the cytotoxicity of the lipid A / IFN is dependent of TLR4 and of the receptor for IFN , and the NOS II expression. We also showed that the radical species, NO and superoxide anion forming peroxynitrite play a crucial role in this cytotoxicity. The origin of these radical species is being NOS II enzyme in a process of decoupling. We also looked for other associated mechanisms that may explain the cytotoxicity of lipid A / IFN . We then showed that NO is able to react with the cysteine residues of certain proteins, a process called S- nitrosylation. A proteomic analysis allowed us to identify at least a dozen proteins that are S- nitrosylated in breast cancer cells in response to lipid A / IFN . We studied the impact of this change on the basis of one of these proteins, the E2 conjugating enzyme UBC13 ubiquitin, a protein involved in cell proliferation and survival. We confirmed the UBC13 nitrosylation on cysteine 87 and identified as a target of NO. The expression of a mutant of UBC13 (replacement of cysteine 87 with alanine) forms inhibits the auto-ubiquitination of the enzyme and its ability to ubiquitinylated one of its targets I B . We have shown that S- nitrosylation of UBC13 induced its translocation to the nucleus and greater sensitivity to the cytotoxic effect of lipid A / IFN in cells. In summary, our results reveal an important and unexpected role of NOS II and NO in the antitumor effect of lipid A OM- 174 in a model of breast cancer in mice opening the way for the development of new cancer treatments. Keywords: TLR4, nitric oxide, NOS II, lipid A, S-nitrosylation, Ubc13, anti-tumor effect 7 Table des matières Table des matières REMERCIEMENTS ............................................................................................................................................. 3 RESUME ........................................................................................................................................................... 6 ABSTRACT ........................................................................................................................................................ 7 TABLE DES MATIERES ....................................................................................................................................... 8 LISTE DES ABRÉVIATIONS ............................................................................................................................... 10 LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX ................................................................................................................... 14 CHAPITRE I : INTRODUCTION .......................................................................................................................... 16 I. LE CANCER DU SEIN ........................................................................................................................................ 16 1. Epidémiologie ...................................................................................................................................... 16 2. Dépistage ............................................................................................................................................. 18 3. Facteurs de risques .............................................................................................................................. 18 4. Inflammation et cancer du sein ........................................................................................................... 19 5. Les différents types de cancers du sein ................................................................................................ 20 6. Classification anatomo-clinique des cancers du sein (pour revue, Espié et Gorins, 2001) .................. 22 7. Les traitements .................................................................................................................................... 23 II. IMMUNOTHERAPIE ANTI-TUMORALE ET LIPIDE A ................................................................................................. 27 1. L’immunothérapie anti-tumorale ........................................................................................................ 27 2. L’immunothérapie par les LPS ............................................................................................................. 29 3. Signalisation du lipide A ....................................................................................................................... 32 4. Interaction IFN et TLR ....................................................................................................................... 39 III. LE MONOXYDE D’AZOTE (NO) ......................................................................................................................... 41 1. Généralité sur le NO ............................................................................................................................. 41 2. Production de NO ................................................................................................................................. 42 3. Les thérapies via le NO......................................................................................................................... 53 4. Mécanismes moléculaire du NO .......................................................................................................... 55 5. Modifications post-traductionnelles des protéines induites par le NO ................................................ 59 IV. UBC13 : UBIQUITIN CONJUGATING ENZYME (E2N) .............................................................................................. 67 1. Signalisation des ubiquitine enzymes .................................................................................................. 67 2. Pathologies associées au système d’ubiquitination ............................................................................. 70 3. Caractéristiques d’Ubc13 ..................................................................................................................... 71 CADRE ET OBJECTIFS DU TRAVAIL .................................................................................................................. 78 CHAPITRE II : RESULTATS ................................................................................................................................ 81 UNCOUPLED INDUCIBLE NITRIC OXIDE SYNTHASE IN TUMOR CELLS PRODUCES PEROXYNITRITE TO MEDIATE THE ANTITUMORAL RESPONSE INDUCED BY TLR4 AGONIST .......................................................................... 85 ANALYSE PROTEOMIQUE DE LA S-NITROSYLATION DANS L’EFFET ANTI-TUMORAL D’UN ANALOGUE DU LIPIDE A : IMPORTANCE D’UBC13 ........................................................................................................................... 128 8 I. PRESENTATION ET OBJECTIFS DE L’ETUDE ......................................................................................................... 128 II. RESULTATS ET DISCUSSIONS ........................................................................................................................... 130 1. Identification des protéines S-nitrosylées par le lipide A et IFN dans les cellules cancéreuses mammaires................................................................................................................................................. 130 2. Confirmation de la S-nitrosylation de l’enzyme de conjugaison de l’ubiquitine E2 Ubc13 et identification de la cystéine cible................................................................................................................ 131 3. Le NO affecte l’ubiquitination d’Ubc13 par S-nitrosylation ............................................................... 132 4. La S-nitrosylation d’Ubc13 affecte sa capacité à ubiquitiner ses cibles ............................................. 134 5. Implication d’Ubc13 dans l’effet cytotoxique du lipide A/IFN ou d’un donneur de NO .................... 135 III. MATERIELS ET METHODES ............................................................................................................................. 138 CHAPITRE III : DISCUSSION ........................................................................................................................... 146 1. Implication du TLR4 de la cellule cancéreuse et de l’hôte. ................................................................. 146 2. Mécanismes de cytotoxicité de la NOS II ........................................................................................... 151 3. Effet de la S-nitrosylation sur la fonction de l’enzyme de conjugaison de l’ubiquitine E2, Ubc13. .... 152 ANNEXE ........................................................................................................................................................ 155 BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................................................ 156 COMMUNICATIONS ECRITES ET ORALES ...................................................................................................... 176 PUBLICATIONS ............................................................................................................................................. 177 9 Liste des abréviations Ac : Anticorps ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADNc : ADN complémentaire Ag : Aminoguanidine ALA: Analogue de Lipide A ALDH : glycéraldéhyde déshydrogénase AP-1: Adaptator Protein 1 ARG: Arginase ARN : Acide RiboNucléique ARNm : Acide RiboNucléique messager ASK 1: Apoptosis Signal regulating Kinase 1 B2-AR: Beta-2 adrenergic receptor BARD1: BRCA1-associated RING domain protein 1 BCG: Bacille de Calmette et Guérin Bcl-2 : B-cell lymphoma-2 protein BCR: B-cell receptor BH4: 6-5, 6, 7, 8-Tetrahydrobiopterine BIR: Baculovirus Inhibitor of apoptosis protein Repeat BRCA1: Breast Cancer 1 BSA: Sérum Albumine Bovine CaM: Calmoduline CAT: Cationic Amino acid Transporter CD: Cluster of Differentiation CMH: Complexe Majeur d'Histocompatibilité CPA: Cellule présentatrice d'Antigène c-PTIO: [2- (4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethyl-imidazoline-1- oxyl-3-oxide] Cys: Cystéine CysNO: nitrosocystéine DAMP: Danger Associatede Molecular Patterns DC: Dendritic Cell DCFH2-DA: 2',7',-dichlorodihydrofluoresceine diacétate DHE: Dihydroéthidium DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMSO: Diméthylsulfoxide DUB: DéUBiquitinase EDRF: Endothelium Derived Relaxing Factor EDTA: Acide Ethylène Diamine Tétraacétique EGF: Epidermal Growth factor EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor EMEM: Eagle’s Minimum Essential Medium EPR: Electron Paramagnetic Resonance EPS15: Epidermal growth factor receptor substrate 15 10