UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA A SAÚDE ANDRÉA BEZERRA DA NÓBREGA OBTENÇÃO DE UM INSUMO FARMACÊUTICO ATIVO VEGETAL A PARTIR DE FOLHAS DE Eugenia florida DC PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM ANTITUMORAL Niterói 2017 ANDRÉA BEZERRA DA NÓBREGA OBTENÇÃO DE UM INSUMO FARMACÊUTICO ATIVO VEGETAL A PARTIR DE FOLHAS DE Eugenia florida DC. PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM ANTITUMORAL Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde, da Universidade Federal Fluminense como requisito para obtenção do título de doutor. Orientador(as): Profa. Dra. SELMA RIBEIRO DE PAIVA – UFF Profa. Dra. GLAUCIA B. C. ALVES SLANA – INPI Niterói 2017 [Espaço para inseri r a ficha catalográfica] UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA A SAÚDE ANDRÉA BEZERRA DA NÓBREGA OBTENÇÃO DE UM INSUMO FARMACÊUTICO ATIVO VEGETAL A PARTIR DE FOLHAS DE Eugenia florida DC PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM ANTITUMORAL BANCA EXAMINADORA Dra. Selma Ribeiro de Paiva – Orientadora Universidade Federal Fluminense – UFF Dra. Glaucia Barbosa Candido Alves Slana – Orientadora Instituto Nacional de Propriedade Industrial – INPI Dra. Débora Omena Futuro (examinador interno) Universidade Federal Fluminense - UFF Dra. Maria Raquel Figueiredo (examinador externo) Farmanguinhos – Fiocruz Dra. Luciana Moreira Chedier (examinador externo) Universidade Federal de Juiz de Fora – UFJF Dr. Edison Luís Santana Carvalho (examinador externo) Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ Dr. Rodrigo Rodrigues de Oliveira (Suplente e Revisor) Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro - UENF __________________________________________________________________ Dra. Helena Regina Pinto Lima (Suplente) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro – UFRRJ Niterói 2017 Dedico este trabalho a minha amada família, pelo constante apoio, incentivo, compreensão e carinho em todos os momentos. AGRADECIMENTOS À Deus pela vida, por ser a minha luz, força, meu conforto e por ter proporcionado a oportunidade de chegar até aqui com mais uma conquista. À minha mãe, pelo amor e orações de cada dia da minha vida. Meu exemplo de força, fé e perseverança para todos os momentos difíceis de minha vida. Às minhas irmãs Cristina, Beatriz, Elizabeth, Clarice, Dilma e Aldemira por todo carinho, amor e incentivo de sempre. Às minhas orientadoras, Dra. Selma Paiva e Dra. Glaucia Slana, por mais uma oportunidade e confiança em meu trabalho, pelos conhecimentos compartilhados, conselhos e palavras de incentivo, enfim, pela paciência e carinho com os quais orientaram este trabalho. Ao Glauco Villas Boas, Coordenador do Núcleo de Gestão e Biodiversidade pela oportunidade de crescimento profissional, concedendo a liberação para realização deste trabalho. Ao amigo Bruno Lessa, pelo apoio técnico e disposição em ajudar nos experimentos. Aos amigos do Laboratório de Química da Biodiversidade pelo apoio técnico e por compreenderem muitas vezes a minha ausência durante este período de capacitação. À Dra. Ana Joffily e ao discente Thiago do Laboratório de Botânica Estrutural e Funcional da UFF, pela colaboração nos estudos de caracterização morfológica. À Dra. Ana Lúcia Ruis do Laboratório de Farmacologia e Toxicologia do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da Universidade Estadual de Campinas pelos ensaios toxicológicos. Ao Dr. André Fuly e ao mestrando Aldo do Laboratório de Venenos e Toxinas de Animais e Avaliação de Inibidores, da Universidade Federal Fluminense, pela colaboração com nos ensaios de hemocompatibilidade. Às discentes Luana, Tatiana, Lorena e Allana, do Laboratório de Botânica Estrutural e Funcional, da Universidade Federal Fluminense, pela colaboração nos ensaios antioxidantes. Ao Dr. Edemilson Cardoso do Laboratório de PD&I de Bioprodutos da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás pela colaboração na secagem dos extratos por Spray Drier. À Dra. Cheila Monthé do Departamento de Processos Orgânicos da UFRJ, pela colaboração nos ensaios de análise térmica. Às coordenações dos Laboratórios de Tecnologia Farmacêutica e de Controle da Qualidade, ambos de Farmanguinhos/Fiocruz por disponibilizar os equipamentos para testes físico-químicos e microbiológicos. À todos, que direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho. SUMÁRIO SUMÁRIO.........................................................................................................................I LISTA DE ABREVIATURAS.....................................................................................VIII LISTA DE TABELAS .................................................................................................XIII LISTA DE FIGURAS.................................................................................................XVI LISTA DE ESQUEMAS.........................................................................................XXVII RESUMO...............................................................................................................XXVIII ABSTRACT.............................................................................................................XXIX 1 INTRODUÇÃO...........................................................................................................33 1.1 Histórico...............................................................................................................33 1.2 Fitoterapia e as Políticas de Saúde Pública..........................................................35 1.3 Desenvolvimento de Fitoterápico........................................................................37 1.3.1 Patrimônio genético e conhecimento tradicional..............................................39 1.3.2 Identificação Botânica......................................................................................40 1.3.3 Cultivo e Fornecedores.....................................................................................41 1.3.4 Metodologia de Extração..................................................................................42 1.3.5 Identificação dos constituintes / marcadores....................................................44 1.3.6 Controle da Qualidade......................................................................................45 1.3.7 Produção do IFAV............................................................................................45 1.3.8 Desenvolvimento de Formulações....................................................................46 1.3.9 Estudo de Estabilidade......................................................................................47 1.3.10 Estudo pré-clínico e clínico............................................................................48 1.3.11 Produção de lotes para comercialização.........................................................48 1.4 Eugenia florida DC..............................................................................................50 2 JUSTIFICATIVA........................................................................................................55 3 OBJETIVOS................................................................................................................56 3.1 Objetivo Geral......................................................................................................56 3.2 Objetivos Específicos..........................................................................................56 4 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................57 4.1 Substâncias de referência, solventes e reagentes.................................................57 4.2 Equipamentos.......................................................................................................57 4.3 Vidrarias...............................................................................................................59 4.4 Levantamento Bibliográfico................................................................................59 I 4.5 Coleta e Identificação do Material Botânico.......................................................59 CAPÍTULO 1.................................................................................................................62 CARACTERIZAÇÃO DA MATÉRIA-PRIMA VEGETAL...............................................62 1. METODOLOGIA......................................................................................................63 1.1 Caracterização da morfologia celular..................................................................63 1.2 Processamento primário da matéria-prima vegetal..............................................64 1.3 Ensaios Microbiológicos......................................................................................65 1.4 Determinação de perda por dessecação...............................................................66 1.5 Determinação de teor de cinzas...........................................................................67 1.5.1 Cinzas totais......................................................................................................67 1.5.2 Cinzas insolúveis em ácido...............................................................................67 1.6 Determinação da distribuição granulométrica.....................................................68 1.7 Densidades aparentes (bruta e compactada)........................................................68 1.8 Índice de intumescência.......................................................................................68 2. RESULTADOS E DISCUSSÕES..............................................................................69 2.1 Caracterização e organização da morfologia celular...........................................69 2.1.1 Região intercostal.............................................................................................69 2.1.2 Bordo................................................................................................................71 2.1.3 Nervura central.................................................................................................72 2.1.4 Pecíolo..............................................................................................................73 2.1.4 Estudo histoquímico.........................................................................................75 2.2 Beneficiamento primário da matéria-prima vegetal............................................77 2.3 Ensaios Microbiológicos......................................................................................78 2.4 Determinação de perda por dessecação...............................................................78 2.5 Determinação do teor de cinzas...........................................................................79 2.6 Determinação da distribuição granulométrica.....................................................80 2.7 Densidade.............................................................................................................81 2.8 Determinação do Índice de Intumescência..........................................................82 3. CONCLUSÃO...........................................................................................................82 CAPÍTULO 2.................................................................................................................84 OBTENÇÃO DE EXTRATOS E PROSPECÇÃO QUÍMICA.........................................84 1. METODOLOGIA.......................................................................................................85 1.1 Seleção de solventes............................................................................................85 1.1.1 Avaliação do perfil extrativo por Cromatografia de Camada Delgada (CCD).86 II 1.1.2 Determinação de fenólicos totais......................................................................86 1.1.3 Determinação de terpenoides totais..................................................................87 1.1.4 Determinação de flavonoides totais..................................................................88 1.2 Obtenção de extratos brutos.................................................................................88 1.3 Fracionamento dos extratos por partição líquido-líquido....................................89 1.4 Prospecção fitoquímica por Cromatografia de Camada Delgada (CCD)............90 1.4.1 Procedimento analítico.....................................................................................90 1.4.2 Preparo dos reveladores para CCD...................................................................91 1.5 Análise das frações por CLAE.............................................................................92 2. RESULTADOS E DISCUSSÕES.............................................................................92 2.1 Seleção de solventes............................................................................................92 2.2 Obtenção de extratos brutos.................................................................................95 2.3 Fracionamento do extrato....................................................................................96 2.4 Prospecção fitoquímica por Cromatografia de Camada Delgada (CCD)............97 2.4.1 Identificação qualitativa de taninos e polifenóis...............................................97 2.4.2 Identificação qualitativa de flavonoides...........................................................98 2.4.3 Identificação de antraquinonas.........................................................................98 2.4.4 Identificação de triterpenos e esteroides...........................................................99 2.4.5 Identificação de cumarinas.............................................................................100 2.4.6 Identificação de alcaloides..............................................................................100 2.4.7 Identificação de saponinas..............................................................................101 2.5 Perfil cromatográfico por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).104 3. CONCLUSÃO.........................................................................................................107 CAPÍTULO 3...............................................................................................................109 ESTUDO FARMACOLÓGICO....................................................................................109 1. MÉTODOS...............................................................................................................110 1.1 Ensaios citotóxicos............................................................................................110 1.1.1 Linhagens celulares.........................................................................................110 1.1.2 Atividade antiproliferativa em cultura de células tumorais humanas.............111 1.2 Teste de hemocompatibilidade..........................................................................113 1.2.1 Coleta da amostra............................................................................................113 1.2.2 Teste de hemocompatibilidade.......................................................................114 1.3 Ensaio de atividade antioxidante.......................................................................114 2. RESULTADOS........................................................................................................116 III