ANA PAULA FIGUEIRA VAZ FERNANDES LEVEDURAS ISOLADAS DE PRODUTOS FRUTÍCOLAS: CAPACIDADE FERMENTATIVA E ESTUDOS SOBRE A H+-ATPase DA MEMBRANA PLASMÁTICA Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Biologia (especialidade Microbiologia), pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia. Lisboa 2008 nº de arquivo “Copyright” ANA PAULA FIGUEIRA VAZ FERNANDES LEVEDURAS ISOLADAS DE PRODUTOS FRUTÍCOLAS: CAPACIDADE FERMENTATIVA E ESTUDOS SOBRE A H+-ATPase DA MEMBRANA PLASMÁTICA Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Biologia (especialidade Microbiologia), pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia. Lisboa 2008 iii Agradecimentos Quero deixar o meu agradecimento à Professora Isabel Spencer-Martins por me ter acolhido e integrado no seu grupo de trabalho, pela sua orientação e sugestões sempre preciosas e que nunca me faltaram. À Helena Rodrigues de Sousa, pela sua orientação nesta tese. O seu entusiasmo e apoio foram importantes para a conclusão deste trabalho. Quero deixar um agradecimento muito especial ao colega César Fonseca que sempre, e de uma forma desinteressada, se disponibilizou a ajudar-me e cuja permanente colaboração favoreceu a execução prática dos trabalhos laboratoriais. Fica a amizade que perdurará por muito e muito tempo. Aos colegas João Inácio e Marco Coelho que sempre se disponibilizaram a ajudar e com quem partilhei momentos de grande companheirismo. Às colegas Vera, Sofia, Sílvia e à Mónica Branco. À colega Maria da Luz, pelo seu exemplo de força de trabalho e incentivo para a execução deste trabalho. Aos colegas da Universidade Aberta: Sandra Caeiro, Ana Paula Martinho e Fernando Caetano. Às Professoras Carla Oliveira, Cristina Carapeto e Filomena Amador da Universidade Aberta. Aos meus pais pelo incentivo e constante cuidado pela filha mais nova. À Lena que sempre me incentivou e motivou para o desenvolvimento deste trabalho. A toda a minha família. Ao Vitor, pela compreensão e especial incentivo ao longo de todo este tempo. Ao Miguel, pelos momentos que foi privado da companhia da mãe. v Resumo São muitas as leveduras capazes de fermentar glucose produzindo etanol e dióxido de carbono. Contudo, Saccharomyces cerevisiae destaca-se pela velocidade com que fermenta e pela concentração de etanol que pode atingir. Algumas estirpes de S. cerevisiae chegam a produzir cerca de 20% v/v etanol, enquanto a maioria das outras leveduras fermentativas deixa de crescer e/ou de fermentar a partir de 6% v/v. Apesar do crescente conhecimento acerca dos alvos celulares associados à toxicidade do etanol, os mecanismos subjacentes aos desempenhos das diferentes leveduras ainda estão longe de ser totalmente conhecidos ou esclarecidos. O objectivo principal deste projecto foi o de identificar mecanismos-chave que possam conduzir a um aumento da eficiência na produção de etanol por leveduras não- Saccharomyces isoladas de fruta comum na alimentação humana (ananás, banana, maçã, manga, papaia, pêssego e uva). Foram objectivos específicos do trabalho realizado: (i) desenvolver um método de hibridação in situ (FISH) para identificação rápida e directa de leveduras que ocorrem em produtos frutícolas; (ii) avaliar a capacidade fermentativa global de leveduras não-Saccharomyces isoladas de produtos frutícolas; (iii) estudar a influência do etanol na H+-ATPase da membrana plasmática em leveduras não-Saccharomyces; e (iv) caracterizar o gene que codifica a H+-ATPase da membrana plasmática em leveduras não- Saccharomyces. Depois de uma introdução geral aos vários aspectos da investigação realizada, no segundo capítulo são apresentados os resultados do isolamento de leveduras e sua identificação. Descreve-se o processo de isolamento de 20 estirpes (representantes de sete espécies pertencendo a seis géneros diferentes) a partir do material escolhido, identificação morfo- fisiológica e bioquímica das leveduras isoladas e a identificação molecular, através da sequenciação da região D1/D2 do gene do RNA ribossómico da subunidade 26S, das leveduras fermentativas. Foram desenvolvidas, e aplicadas, sondas oligonucleotídicas específicas para a detecção directa e identificação, através do método de hibridação in situ (FISH), de quatro espécies de leveduras que ocorreram com maior frequência na fruta amostrada: Candida quercitrusa, C. pseudointermedia, Pichia guilliermondii e Hanseniaspora uvarum. vii O terceiro capítulo incide sobre a avaliação global da capacidade fermentativa de sete leveduras seleccionadas, através da determinação de dois parâmetros: a concentração máxima de etanol produzido e as velocidades específicas de fermentação e de respiração. Tendo em vista comparar de forma expedita leveduras com capacidades fermentativas marcadamente diferentes, foi desenvolvido um método com base na perda da viabilidade celular em função da concentração de etanol adicionado ao meio de cultura e temperatura de incubação. Os ensaios foram realizados em duas condições: 11% v/v etanol/30 ºC e 20% v/v etanol/16 ºC. O capítulo termina com a determinação da actividade da ATPase da membrana plasmática, essencial para a célula responder com eficácia à agressão pelo etanol, das espécies de levedura isoladas. Nestes estudos foram utilizados como termo de comparação a bem estudada S. cerevisiae e a sua espécie muito próxima S. bayanus. O quarto capítulo é dedicado à caracterização da H+-ATPase da membrana plasmática das espécies de levedura seleccionadas. Foi determinado o pH óptimo para a actividade da H+- ATPase, assim como avaliada a influência do etanol presente no meio de cultura nessa actividade. Com base em regiões conservadas do gene PMA1 da H+-ATPase da membrana plasmática de leveduras cujas sequências genómicas já estão disponíveis publicamente, procedeu-se à pesquisa do gene PMA1 nas espécies não-Saccharomyces seleccionadas neste estudo. Os fragmentos amplificados por PCR foram sequenciados e as sequências obtidas foram analisadas com dois objectivos: a) tentar compreender se as diferenças detectadas se poderão relacionar com as diferentes características fenotípicas observadas; e b) avaliar a possibilidade de inferir sobre relações filogenéticas entre espécies. A dissertação termina com considerações globais sobre os resultados obtidos e apresentação de perspectivas para trabalho futuro no tópico abordado no presente trabalho. viii