UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIA ANIMAL Ana Janaina Jeanine Martins de Lemos Administração associativa do cloridrato de metformina e melatonina na reversão da policistose ovariana e os efeitos sobre o fígado e reprodução em ratas albinas Recife 2013 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIA ANIMAL ANA JANAINA JEANINE MARTINS DE LEMOS “Administração associativa do cloridrato de metformina e melatonina na reversão da policistose ovariana e os efeitos sobre o fígado e reprodução em ratas albinas” Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biociência Animal da Universidade Federal Rural de Pernambuco, como pré-requisito para obtenção do título de Doutor em Biociência Animal. Área de Morfofisiologia. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Valéria Wanderley Teixeira Co-orientadores: Prof. Dr. Álvaro Aguiar Coelho Teixeira Prof.ª Dr.ª Christina Alves Peixoto RECIFE 2013 Ficha catalográfica L555r Lemos, Ana Janaina Jeanine Martins de “Administração associativa da metformina e melatonina na reversão da policistose ovariana e os efeitos sobre o fígado e reprodução em ratas albinas” / Ana Janaina Jeanine Martins de Lemos. -- 2012. 93 f. : il. Orientadora: Valéria Warderley-Teixeira. Tese (Doutorado em Biociência Animal) – Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Morfologia e Fisiologia, Recife, 2010. Inclui referências e anexo. 1. Síndrome dos ovários policísticos 2. Melatonina 3. Cloridrato de metformina 4. Fertilidade 5. Fígado 6. Estresse oxidativo .I Warderley-Teixeira, Valéria, orientadora II. Título CDD 591.824 ANA JANAINA JEANINE MARTINS DE LEMOS “Administração associativa do cloridrato de metformina e melatonina na reversão da policistose ovariana e os efeitos sobre o fígado e reprodução em ratas albinas” Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biociência Animal da Universidade Federal Rural de Pernambuco, como pré-requisito para obtenção do título de Doutor em Biociência Animal. Área de Morfofisiologia. Aprovada em 22 de outubro de 2013 . BANCA EXAMINADORA: ___________________________________ Profª. Drª. Valéria Wanderley Teixeira (Orientadora) - UFRPE ___________________________________ Prof. Dr. Álvaro Aguiar Coelho Teixeira - UFRPE ___________________________________ Profª. Drª. Christina Alves Peixoto – Fundação Oswaldo Cruz ___________________________________ Prof. Dr. Fabiano Séllos Costa - UFRPE __________________________________ Prof. Dr. Anísio Francisco Soares - UFRPE AGRADECIMENTOS A realização desta etapa de minha vida profissional é uma vitória que foi alcançada com muito esforço e barreiras. Os amigos e familiares foram verdadeiras correntes que sustentaram os pilares necessários para construção da tese. Dentre os vários amigos, e perdoem-me os não citados, pois foram muitos, desejo agradecer primeiramente a Deus, pois nele depositei minhas forças e mantive minha fé nos momentos mais difíceis. Agradeço a meus pais, ambos me fazem sentir muito amada, às vezes até paparicada com muito carinho, fico emocionada sempre que falo destas pessoas tão especiais, em especial minha mãe, Ana Cristina Lemos por estar sempre cobrando meu empenho e estimulando meu crescimento. Aos meus pais acadêmicos, Profª. Valéria Teixeira e Prof. Álvaro Teixeira por serem de fato orientadores na minha vida tanto profissional quanto pessoal, vocês são amigos verdadeiros, do tipo que reclama e elogia de maneira justa, sempre pensando no nosso melhor. Serei eternamente agradecida, vocês são um exemplo para mim, eu amo muito vocês. Agradeço aos amigos do laboratório, pois todos levaram junto comigo as atividades necessárias à elaboração do experimento, além de serem sempre companheiros e alegres. Nós somos uma super equipe! Alguns nomes dentre vários que posso citar são: Solange Bezerra, Cinthia Giselle Martins, Shimene Figueirôa, Hilda Santos, Eduardo Silva, Fernanda Tenório, Carolline Guimarães, Clóvis Lapa Neto e nossa agregada Cibele Alves, entre outros. Nestes últimos anos do curso, fiz novas amizades e renovei algumas amizades antigas com meninas que também levaram junto comigo as atividades necessárias à elaboração dos artigos, todas as amigas do Aggeu Magalhães e Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (CETENE), como as amigas Rayana Leal, Sura Rocha, Gabrielle Oliveira, Wilma Oliveira, Karolina Nunes, Amanda Silva, entre outras. Além da responsável pela competência de todas estas amigas e a quem tive a honra de ter como co-orientadora, sempre disposta a ajudar, a sincera Profª Christina Peixoto à qual tenho grande admiração e respeito, serei sempre agradecida. À Pós-graduação, por proporcionar o desenvolvimento do curso e por apoiar todas as atividades desenvolvidas, também aos Professores e colegas da pós-graduação, I sempre dispostos a ajudar e aperfeiçoar as ideias prévias do Projeto enquanto desenvolvimento, também ao Reuni por auxiliar financeiramente minha manutenção no curso. Este recurso foi fundamental às atividades desenvolvidas ao longo destes anos. À UFRPE, esta instituição é minha segunda casa, eu a frequento desde sempre e devo-lhe toda minha formação acadêmica. Nesta casa fui sempre bem recebida por todos e tive o prazer de participar de várias atividades que proporcionaram construir amizades que jamais serão esquecidas. Em destaque estão as Pró-reitorias de Atividade de Extensão e de Ensino de Graduação, bem como os Departamentos de Registro e Controle Acadêmico e de Morfologia e Fisiologia Animal. Agradeço ao nosso bioterista e querido amigo Marcos André, por ser sempre muito dedicado a manutenção dos animais e preocupando-se com nossas atividades, seu apoio é fundamental. Aos meus irmãos e sobrinhos, minhas paixões, vocês são as alegrias da minha vida. E por último, mas não menos importante, o meu futuro marido, sempre namorado, meu noivo João Carlos Jordão. Meu lindo, você foi quem mais acompanhou minhas angústias e incertezas. Fomos cumplices, companheiros, amigos... Você me completa. Espero ficar velhinha ao seu lado. II RESUMO A síndrome do ovário policístico (SOP) é um distúrbio endócrino feminino extremamente comum na idade reprodutiva e apresenta quadro clínico bastante heterogêneo, entre eles os cistos foliculares ovarianos aumentados, hiperandrogenismo, infertilidade resistência à insulina, e dislipidemia. Em casos de pacientes com policistose ovariana que desejam tratar a infertilidade, o cloridrato de metformina é a droga mais utilizada e considerada mais segura em comparação com os demais tratamentos. Ao diagnosticar a síndrome, tem-se observado que mulheres apresentam grande prevalência a doença hepática gordurosa não alcoólica, esteatose, fibrose, alterações hepático-enzimáticas e aumento do estresse oxidativo plasmático, elevando a preocupação dos médicos quanto às patologias hepáticas. Além disso, recentes estudos têm relacionado o estresse oxidativo na patogênese de doenças que causam a infertilidade, por esta razão, pesquisas tem sugerido a utilização de antioxidantes como a melatonina como suplemento a outras drogas. No entanto, não há relatos na literatura sobre a associação do cloridrato de metformina e melatonina para o tratamento da policistose ovariana. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da combinação terapêutica desses fármacos em ratas induzidas à SOP sobre os aspectos reprodutivos e hepáticos. Para tanto, foram utilizadas 75 ratas albinas, divididas aleatoriamente em cinco grupos de 15 animais. Todas as ratas, exceto as do grupo I, foram submetidas à indução da SOP pela iluminação constante, e as ratas dos grupos III, IV e V receberam tratamentos com os fármacos melatonina, cloridrato de metformina e a associação destes, respectivamente. Após a confirmação da SOP e tratamentos, foram analisados os efeitos plasmáticos bioquímicos e hormonais dos tratamentos, e as ratas foram acasaladas para análise dos sítios de implantação e acompanhamento gestacional dos níveis de estresse oxidativo. Ao final do experimento foi analisada a histopatologia e imunohistoquímica do fígado das ratas. Os tratamentos farmacológicos diminuíram o número de dias para confirmação do acasalamento, aumentaram os níveis séricos de progesterona, bem como o número e o peso dos filhotes. Reduziram os níveis plasmáticos de estrógeno e teor de fibras colágenas. No fígado, os tratamentos com cloridrato de metformina, melatonina, e mais significativamente a associação destes fármacos, reduziram os níveis plasmáticos da enzima hepática alanina transaminase, do óxido nítrico e da glutationa total, III levando a resultados semelhantes aos animais do grupo controle, mais uma vez, as ratas que receberam associação dos fármacos quanto assemelhou-se ao grupo controle quanto ao conteúdo hepático de polissacarídeos, e aos de citocinas pró- inflamatórias. Desta forma, pôde-se concluir que a associação do cloridrato de metformina com melatonina proporciona os melhores resultados em comparação aos demais tratamentos, de forma a regular hormonal e histoquimicamente o sistema reprodutor e aumentar as chances de concepção de forma semelhante ao grupo controle. No fígado a associação dos fármacos atuou de forma mais eficaz contra a toxicidade hepática produzida pela SOP experimental, favorecendo uma normalização dos parâmetros bioquímicos e estresse oxidativo durante a gestação, quando comparada às monoterapias destas drogas. PALAVRAS-CHAVE: Síndrome dos ovários policísticos, biguanida, melatonina, reprodução, fígado, estresse oxidativo. IV ABSTRACT The polycystic ovary syndrome (PCOS) is endocrine disorder in women of reproductive age extremely common and heterogeneous clinical features. In cases of patients with ovarian polycystic wishing to treat infertility, metformin hydrochloride is the drug most widely used and considered safer compared to the other treatments. When diagnosing the syndrome, it has been observed that women have a high prevalence of nonalcoholic fatty liver disease, steatosis, fibrosis, abnormal liver- enzyme factors and increased indicators of oxidative stress in plasma, raising concern among doctors about the disease in the liver. Furthermore, recent studies have linked oxidative stress in the pathogenesis of diseases which cause infertility, for this reason, research has suggested the use of antioxidants such as melatonin, due to liver protecting effect in the pharmacological treatment or supplementation to combat these types of disease. However, there are no reports in the literature about association of metformin hydrochloride and melatonin for the treatment of PCOS. The objective of this work was to investigate the effects of combination therapy of these drugs in rats induced to PCOS on to reproductive and liver. Thus, we used 75 albino rats were divided randomly into five groups of 15 animals. All rats except those in group I were subjected to induction of PCOS by constant illumination, and the rats of groups III, IV and V received treatment with the drug melatonin, metformin hydrochloride and the drug combination, respectively. After confirmation of PCOS and treatments, we analyzed the effects of plasma biochemical and hormonal treatments, and rats were mated and monitored during pregnancy for analysis of implantation sites, ovarian, weight gain, reproductive viability and levels of oxidative stress. At the end of the experiment was conducted histopathology, and immunohistochemistry staining of liver of rats and analysis of the puppies. Pharmacological treatments decreased the time allowed copulation, increased plasma levels of progesterone, the number and weight of pups and reduced plasma levels of estrogen and endometrial content of collagen fibers. In the liver, treatment with metformin hydrochloride, melatonin and more significantly the association of these drugs reduced plasma levels of the liver enzyme alanine trasaminase, nitric oxide and total glutathione, leading to results similar to the control group, were also observed similarities between those of control rats and rats that received a V combination of drugs for the content of hepatic polysaccharide, and of pro- inflammatory cytokines. Thus, we conclude that the association of metformin with melatonin provides the best results compared to the other treatments, in order to regulate hormonal and histochemical the reproductive system and increase the chance of conception resembling the control group, and the liver, the combination of drugs works more effectively against liver toxicity produced by PCOS, favoring normalization of biochemical parameters and oxidative stress during pregnancy, compared to therapies only these drugs. KEYWORDS: Polycystic ovary syndrome, biguanide, melatonin, reproduction, liver, oxidative stress. VI