ALMA MATER STUDIORUM-UNIVERSITÀ DI BOLOGNA DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE E TECNOLOGIE AGRARIE, AMBIENTALI E ALIMENTARI XXVIII CICLO Settore Concorsuale di afferenza: 07/D1 Settore Scientifico disciplinare: AGR11 ATTIVITA’ BIOLOGICA DI ALCUNI OLI ESSENZIALI E LORO COMPONENTI NEI CONFRONTI DI MYZUS PERSICAE. Presentata da: Giulio Marianacci COORDINATORE DEL DOTTORATO RELATORE Chiar.mo Prof. Giovanni Dinelli Chiar.mo Prof. Stefano Maini Esame Finale anno 2017 1 INDICE 1. INTRODUZIONE……………………………………………………………….. 3 2. GLI OLI ESSENZIALI…………………………………………………………… 6 2.1. Brevi cenni storici sull’uso degli oli essenziali…………… 6 2.2. Metodi di estrazione e caratteristiche degli oli essenziali…………………………………………………………………. 7 2.3. Biosintesi degli oli essenziali…………………………………….. 10 2.4. Effetti biologici degli oli essenziali……………………………. 12 2.5. Impiego degli oli essenziali come insetticidi…………….. 14 2.6. L’afide verde del pesco: ciclo biologico, danni provocati e strategie di difesa………………………………………………….. 17 3. MATERIALI E METODI………………………………………………………. 21 3.1. Scopo della ricerca…………………………………………………… 21 3.2. Prove preliminari……………………………………………………… 21 3.2.1. Allevamento di Myzus persicae Sulzer su Pisum sativum L………………………………………………………….. 23 3.2.2. Principi attivi e oli essenziali utilizzati………………. 28 3.3. Emulsionanti ed insetticidi di sintesi utilizzati………….. 32 3.4. Metodi…………………………………………………………………….. 32 3.5. Analisi statistica……………………………………………………….. 37 4. RISULTATI E DISCUSSIONE……………………………………………….. 38 4.1. Risultati……………………………………………………………………. 38 4.2. Discussione……………………………………………………………… 69 5. CONCLUSIONI………………………………………………………………….. 73 6. BIBLIOGRAFIA CITATA……………………………………………………… 74 2 1. INTRODUZIONE Uno dei principali problemi dell’agricoltura, sin dalla sua nascita, è il controllo degli insetti dannosi per le piante coltivate. Nell’ultimo secolo la lotta è stata condotta mediante l’utilizzo di composti organici di sintesi. Questi, in un primo momento, hanno rappresentato un sistema di controllo efficace e lasciato intravedere una risoluzione definitiva del problema. Ma le straordinarie capacità di sopravvivenza e adattamento degli insetti hanno rivelato i limiti di queste tecniche di difesa e, con il tempo, sono emersi ulteriori problemi direttamente collegati all’utilizzo degli insetticidi di sintesi. L’inquinamento dell’ambiente soprattutto ad opera dei composti più persistenti, l’instabilità dovuta alla estrema semplificazione degli agroecosistemi e i danni alla salute dei lavoratori del settore e dei consumatori sono gli aspetti più evidenti degli effetti collaterali dell’uso di queste tecniche di lotta. La consapevolezza di dover trovare delle strategie alternative si è fatta strada a partire dagli anni sessanta del secolo scorso e nell’arco di qualche decennio ha portato alla definizione di tecniche di difesa più rispettose dell’ambiente e della salute pubblica. Hanno contribuito a ciò anche l’introduzione di norme più restrittive all’impiego delle sostanze di sintesi e la sempre maggiore attenzione dei consumatori verso prodotti biologici. Anche l’attenzione verso i processi produttivi rispettosi dell’ambiente e della dignità dei lavoratori è aumentata nel tempo e insieme alle problematiche relative alla sicurezza alimentare hanno determinato, nel nuovo millennio, un incremento delle forme di agricoltura alternative alla grande agricoltura industrializzata. L’agricoltura urbana e le varie forme di agricoltura biologica ne sono un esempio. 3 Secondo la Federazione Internazionale dei Movimenti per l’Agricoltura Biologica (IFOAM) alla fine del 2015 circa 60 milioni di ettari nel mondo erano coltivati secondo i metodi dell’agricoltura biologica, 6,5 milioni di ettari in più rispetto al 2014. Una crescita, secondo l’IFOAM, mai registrata prima. Anche l’agricoltura urbana è destinata a diventare una realtà stabile di molte città dei paesi poveri e ricchi (Gianquinto e Tei, 2010). Secondo gli autori essa contribuirà alla sicurezza alimentare dei cittadini soprattutto nei paesi più poveri e al miglioramento delle loro condizioni di salute. Il potenziale produttivo dell’agricoltura urbana e i benefici che essa può apportare in termini di incremento della biodiversità e diminuzione delle emissioni dei gas serra sono oggetto di studi sempre più numerosi. Uno di questi ha riguardato la città di Bologna ed ha dimostrato che se venissero coltivati tutti i terrazzi e i tetti piani si avrebbe a disposizione una superficie di 80 ettari che produrrebbe circa 12,495 t di vegetali freschi l’anno, ossia il 77% del fabbisogno annuo della città (Orsini et al.,2014). L’agricoltura urbana e più in generale le questioni riguardanti l’ecologia in ambiente urbano hanno assunto negli ultimi anni un rilievo maggiore che in passato. Ma ad una crescita di interesse su questi temi non è corrisposto una adeguata attività di ricerca riguardante la gestione, dal punto di vista fitosanitario, di sistemi di piccole dimensioni e in ambienti fortemente antropizzati. Le problematiche e le possibili soluzioni relative alla lotta biologica agli insetti dannosi in piccoli sistemi sono infatti diverse da quelle relative alle aziende agricole di medie e grandi dimensioni e vanno indagati in modo specifico. L’agricoltura urbana, quindi, non è esente da rischi e tra questi sicuramente vanno annoverati quelli legati ad un uso improprio dei fitofarmaci. 4 L’uso degli estratti vegetali con proprietà insetticide, se efficaci, potrebbe rappresentare una valida alternativa ai prodotti organici di sintesi. Tra questi meritano di essere studiati gli oli essenziali. 5 2. GLI OLI ESSENZIALI. 2.1 Brevi cenni storici sull’uso degli oli essenziali Sebbene il processo di distillazione come metodo per produrre gli oli essenziali sia stato usato in Egitto, India e Persia più di 2000 anni fa e sia stato migliorato ad opera degli Arabi durante il IX secolo, la prima testimonianza scritta sulle modalità di estrazione dagli organi vegetali risale al XIII secolo ed è dovuta all’opera del fisico catalano Villanova (Guenther, 1948). Durante il basso medioevo gli oli essenziali erano prodotti dai farmacisti e i loro effetti farmacologici erano descritti dalla farmacopea dell’epoca (Bauer et al., 2001). Ciò nonostante, il loro uso in Europa rimase limitato fino al XVI secolo, quando cominciarono ad essere commercializzati nella City di Londra (Crosthwaite, 1998). Nel corso del XVII secolo la produzione degli oli essenziali era un procedimento ben conosciuto e le farmacie potevano averne a disposizione anche 15-20 diversi (Gaunther, 1948). Bisogna attendere però la fine del XVIII secolo per avere notizie certe sull’uso di un olio essenziale per scopi medici (Carson e Riley, 1993) e la fine del secolo successivo per i primi esperimenti sulle proprietà battericide di queste essenze (Boyle, 1955). Nel corso degli ultimi due secoli, comunque, l’uso degli oli essenziali a scopo medico diventa secondario rispetto al loro uso come aromi nell’industria alimentare e come fragranze nell’industria dei profumi (Guenther, 1948). Nell’ultimo mezzo secolo, inoltre, si è andato via via affermando l’interesse per l’uso degli oli essenziali come prodotti naturali per il controllo degli insetti dannosi; l’attenzione per questo nuovo campo d’impiego è dimostrato dalle migliaia di lavori scientifici pubblicati sulle riviste specializzate di tutto il mondo (Regnault- Roger et al., 2012). 6 2.2 Metodi di estrazione e caratteristiche degli oli essenziali Gli oli essenziali sono composti naturali di natura complessa ottenuti mediante distillazione in corrente di vapore, idrodistillazione, distillazione a secco o spremitura a freddo di organi vegetali. (European Pharmacopoeia, 2008). Il metodo classico di estrazione è quello basato sulla distillazione in corrente di vapore. Usato anche su scala industriale, il metodo richiede apparati di grandi dimensioni per contenere la biomassa vegetale da cui estrarre gli oli essenziali ed è molto costoso perché la distillazione richiede elevate temperature. Le essenze estratte dagli agrumi rappresentano una eccezione a questo metodo: grandi quantità di prodotto possono essere ottenuti mediante la spremitura a freddo degli esocarpi dei frutti (Regnault-Roger et al., 2012). Una variante della distillazione in corrente di vapore è l’idrodistillazione nella quale il materiale vegetale è immerso in acqua che viene scaldata fino ad ebollizione. Si genera in questo caso un flusso di vapore che trasporta l’olio essenziale nel condensatore e poi nel sistema di decantazione. Metodi più moderni di estrazione prevedono l’uso di microonde e di fluidi come l’anidride carbonica supercritica che trovandosi ad uno stadio intermedio tra quello gassoso e quello liquido ha elevate capacità solvatanti (Regnault-Roger et al., 2012). I differenti metodi di estrazione incidono sulle caratteristiche finali del prodotto (Chiasson et al., 2001). Gli autori hanno comparato le caratteristiche chimiche e le proprietà acaricide degli oli essenziali di Artemisia absinthium L. e Tanacetum vulgare L. estratti mediante l’uso di microonde, idrodistillazione e distillazione in corrente di vapore. La diversa composizione chimica, rilevata mediante gascromatografia, degli oli essenziali estratti in corrente di vapore rispetto agli altri due metodi di estrazione era all’origine, secondo gli autori, della loro maggiore efficacia acaricida. 7 Gli oli essenziali vengono estratti da decine di migliaia di piante diverse appartenenti soprattutto alle famiglie delle Myrtaceae, Lauraceae, Lamiaceae e Asteraceae (Regnault-Roger et al., 2012). La sintesi e l’accumulo di queste essenze avviene all’interno di strutture secretorie diverse nelle varie famiglie: cavità secretrici nelle Myrtaceae e Rutaceae, tricomi ghiandolari nelle Lamiaceae e condotti resiniferi nelle Asteraceae e Apiaceae (Rodriguez et al., 1984). Gli oli essenziali inoltre vengono immagazzinati in organi diversi nelle diverse specie di piante: nei fiori [bergamotto, Citrus aurantium L. spp bergamia (Risso Poit) Wight Arn], nelle foglie   (citronella, Citronella spp., eucalipto Eucalyptus spp), nel legno (sandalo, Sandalus spp.), nelle radici (vetiver, Chrysopogon zizanioides(L.) Roberty), nei rizomi (zenzero, Zingiber officinale Roscoe; curcuma, Curcuma longa L.), nei frutti (anice, Pimpinella anisumL.) e nei semi (noce moscata, Myristica fragrans Houtt.) (Regnault-Roger et al., 2012). La composizione degli oli essenziali è molto variabile e dipende da numerosissimi fattori tra cui, come abbiamo visto sopra, anche i metodi di estrazione. Anche quando il metodo di estrazione è lo stesso, le variazioni nella composizione degli estratti vegetali sono la norma. D’altra parte la variabilità nella composizione chimica di una merce proveniente da estratti vegetali non dovrebbe essere una sorpresa per tutti gli operatori del settore, come non lo è per tutti coloro che apprezzano il caffè, il tè, il vino o il cioccolato (Isman, 2006). La composizione chimica degli oli essenziali estratti da piante della famiglia delle Lamiaceae, per esempio, dipende dall’ambiente di coltivazione, dai metodi di coltivazione e dalle condizioni di stress delle piante (Delfine et al., 2005; Russo et al., 2013). Quella degli oli provenienti dalle specie del genere Lavandula cambiano a secondo delle parti della pianta analizzata (Skoula et al., 1996; Gonzàles-Coloma et al., 2011), dei fattori ambientali (Munoz-Bertomeu et al., 2007), del metodo di 8 estrazione (Kim e Lee, 2002; Fakhari et al., 2005) e delle specie utilizzate (Touati et al., 2011). Anche il suolo di coltivazione può influire in maniera significativa sulla composizione di un olio essenziale. Flamini et al. (2011) hanno eseguito uno studio sulla composizione chimica degli oli essenziali estratti da due popolazioni di Teucrium flavum L. subsp. flavum presenti su calcare sul promontorio del Caprione (Liguria orientale) e su ofioliti fra Nebbia e Gabbro (Colline livornesi). L’olio essenziale ottenuto dalle piante raccolte su calcare aveva una percentuale di monoterpeni del 47,7% mentre quelle raccolte su ofioliti del 61,2%; i sesquiterpeni invece erano più abbondanti nelle piante raccolte su calcare (42,6%) rispetto alle piante raccolte su ofioliti (22,7%). E ancora, l’olio essenziale estratto dall’Artemisia vulgaris L. presenta differenze qualitative e quantitative in funzione del paese di coltivazione (Govindaraj and Kumari, 2013). La composizione di quello di Eucalipto dipende dalla specie, dall’ambiente di coltivazione, dal clima, dalla stagione, dall’età delle foglie, dal tipo di suolo e non ultimo dai metodi di disidratazione del materiale e di estrazione dell’olio essenziale (Batish et al., 2008). L’olio essenziale di rosmarino estratto da piante raccolte in due zone diverse dell’Italia contengono concentrazioni di 1,8-Cineolo che variano dal 7% al 55% e di - pinene dall’11% al 36% (Isman et al., 2007). La grande variabilità nella composizione degli oli essenziali rende necessaria la loro caratterizzazione mediante gascromatografia (GC) associata a un rilevatore di spettrometria di massa (MS) o, molto diffuso, ad un rilevatore a ionizzazione di fiamma (FID-Flame Ionization Detector) che consentono di determinare le varie miscele di composti organici. Naturalmente questa variabilità ha importanti conseguenze sull’attività biologica di queste essenze tanto che la produzione e la standardizzazione dei vari prodotti rappresentano una sfida per questo settore (Regnault-Roger et al., 2012). 9 2.3 Biosintesi degli oli essenziali. Gli oli essenziali sono un miscuglio eterogeneo di numerosi composti chimici prodotti dal metabolismo secondario delle piante. In genere sono costituiti da 20-60 composti a differente concentrazione di cui due o tre rappresentano il 20-70% dell’essenza mentre gli altri sono presenti in tracce (Bakkali et al., 2008). I principali costituenti, tutti caratterizzati dall’avere un basso peso molecolare, sono molecole appartenenti alla famiglia dei terpeni, dei terpenoidi , ossia terpeni contenenti ossigeno, e in minor misura dei fenilpropanoidi (Regnault-Roger et al., 2012; Pichersky et al., 2006). Terpeni e terpenoidi sono i prodotti naturali più abbondanti e più ampiamente diffusi nelle piante (Capasso e Violante, 2003). Sono composti caratterizzati da una notevole varietà strutturale costituiti da una o più unità isopreniche a cinque atomi di carbonio (C ), legate tra loro secondo un sistema 5 detto testa-coda (Capasso e Violante, 2003). Possono essere distinti in emiterpeni (C ) costituiti da una singola unità isoprenica, 5 monoterpeni (C ) costituiti da due unità isopreniche, 10 sesquiterpeni (C ) da tre unità isopreniche, diterpeni (C ) da 15 20 quattro unità isopreniche, sesterterpeni (C ) da cinque unità 25 isopreniche diffusi nei microrganismi e i triterpeni (C ) costituiti da 30 sei unità isopreniche. Negli oli essenziali sono presenti i composti più volatili e profumati, soprattutto monoterpeni e sesquiterpeni e in minore misura i composti aromatici derivati dal fenilpropano (fig.2.1). I monoterpeni possono essere regolari, molto più comuni, e irregolari e comprendono composti lineari o ciclici. Dalla struttura base dei monoterpeni regolari attraverso reazioni di ossidoriduzione si possono formare gruppi funzionali tipici degli 10