Alma Mater Studiorum Università di Bologna FACOLTA’ DI MEDICINA VETERINARIA Corso di Dottorato di Ricerca in “Diagnostica Collaterale in Medicina Interna Veterinaria” XX ciclo Settore Scientifico Disciplinare: VET 08 Dipartimento Clinico Veterinario Sezione di Medicina Interna IMPORTANZA PROGNOSTICA DELLE CITOCHINE E LORO RUOLO NELL'IMMUNOMODULAZIONE: RISULTATI DI STUDI SPERIMENTALI IN VIVO E IN VITRO. Dottorando: dott. Andrea Bonato Coordinatore del Dottorato Relatore: Chiar.mo Prof. Paolo Famigli Bergamini Dott. Angelo Peli Esame finale 2008 INDICE INTRODUZIONE 2 PARTE GENERALE 3 1. RISPOSTA IMMUNITARIA ED INFIAMMAZIONE 4 1.1. RISPOSTA IMMUNITARIA INNATA 6 1.1.1. Componenti dell’immunità innata 6 1.1.1.1. Barriere epiteliali 6 1.1.1.2. Granulociti neutrofili 6 1.1.1.3. Monociti/macrofagi (fagociti mononucleati) 7 1.1.1.4. Linfociti Natural Killer (NK) 8 1.1.1.5. Sistema del complemento 8 1.1.1.6. Citochine 9 1.1.1.7. Proteine di fase acuta 9 1.2. RISPOSTA IMMUNITARIA ACQUISITA 11 1.2.1. Componenti dell’immunità acquisita 11 1.2.1.1. Linfociti B 12 1.2.1.2. Linfociti T 12 1.2.2. Immunità cellulo-mediata 13 1.2.3. Immunità umorale 15 1.3. FASI DEL PROCESSO FLOGISTICO 16 1.3.1. Riconoscimento dei patogeni 16 1.3.1.1. Toll Like Receptor (TLR) 16 1.3.1.2. I superantigeni microbici 17 1.3.2. Reclutamento 19 1.3.3. Rimozione 20 1.3.4. Risoluzione 20 1.4. RISPOSTA INFIAMMATORIA SISTEMICA 22 1.5. CLASSIFICAZIONE SIRS/SEPSIS 25 1.6. MARKER DI SIRS/SEPSIS 29 1.6.1. Marker plasmatici 29 1.6.1.1. Endotossine 29 1.6.1.2. Citochine 29 1.6.1.3. Procalcitonina 34 1.6.1.4. Proteina C reattiva 36 1.6.1.5. Neopterina 36 1.6.1.6. Marker endoteliali 36 1.6.1.7. Componente C3a del complemento 37 1.6.2. Cinetica dei marker plasmatici 37 1.6.3. Marker associati a cellule 38 1.6.3.1. MCH-II 38 I 1.6.3.2. CD14 38 2. LE CITOCHINE 39 2.1. Proprietà delle citochine 39 2.2. Le famiglie strutturali 42 2.3. Funzioni biologiche 43 2.4. Recettori citochinici 45 2.5. Segnali di attivazione recettoriale 47 2.6. Antagonisti delle citochine 49 2.7. Secrezione di citochine da parte di sottopopolazioni linfocitarie T helper 1 (Th1) e T helper 2 (Th2) 50 2.8. Esempi di patologie coinvolgenti citochine 52 2.8.1. Lo shock settico di natura batterica 52 2.8.2. Shock tossico batterico causato da superantigeni 52 2.8.3. Neoplasie di natura linfoide e mieloide 53 2.8.4. Malattia di Chagas 54 2.9. Uso terapeutico delle citochine e dei loro recettori 54 2.10. Interleuchina 1 Beta (IL 1β) 56 2.11. Interleuchina 2 (IL 2) 66 2.12. Interleuchina 4 (IL 4) 75 2.13. Interleuchina 6 (IL 6) 80 2.14. Interleuchina 8 (IL 8) 90 2.15. Interleuchina 10 (IL 10) 94 2.16. Tumor Necrosi Factor Alfa (TNF α) 104 2.17. Interferone gamma (IFN γ) 112 PARTE SPERIMENTALE 131 3. METODICHE 132 3.1. Estrazione dell'acido ribonucleico (RNA) 132 3.1.1. Estrazione dell’RNA mediante TRI REAGENT 132 3.1.2. Estrazione dell’RNA mediante QIAamp RNeasy Mini Kit (Qiagen) 132 3.2. Trattamento con DNAsi 133 3.3. Retrotrascrizione a cDNA (RT) 134 3.4. Polymerase Chain Reaction (PCR) 136 3.4.1. Specificità dell’amplificazione e selezione dei primers 137 3.4.2. Elettroforesi su gel di agarosio 144 3.5. Sequenziamento degli amplificati 144 3.6. Purificazione e clonazione di frammenti 145 3.7. Real Time PCR 147 3.7.1. Espressione dei risultati di Real Time PCR 150 3.8. Prelievo e maturazione di cellule derivanti da midollo osseo 152 3.9. Prelievo e preparazione degli splenociti 152 3.10. Proliferazione linfocitaria mediante timidina triziata 3(H)T 153 3.11. Quantificazione proteica con metodo Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 153 3.12. Quantificazione citochinica mediante Bioplex (Bio Rad) 155 3.13. Citometria a flusso 155 3.13.1. Basi tecniche di citometria a flusso 156 II 3.14. Analisi statistica 159 4. SPERIMENTAZIONI REALIZZATE 160 4.1. Sperimentazione 1 Ruolo esercitato da recettori attivati dai proliferatori dei perossisomi di tipo alfa (PPAR-α) nella regolazione dell'infiammazione acuta 160 4.1.1. Introduzione 160 4.1.2. Materiale e Metodi 162 4.1.3. Risultati 165 4.1.4. Discussione e Conclusioni 172 4.2. Sperimentazione 2 Effetti del 17β-estradiolo nella trasduzione del segnale e nel danno secondario in lesione al midollo spinale sperimentalmente indotta 175 4.2.1. Introduzione 175 4.2.2. Materiale e Metodi 176 4.2.3. Risultati 179 4.2.4. Discussione e Conclusioni 182 4.3. Sperimentazione 3 Valutazione dell'attività immunomodulatoria esercitata da componenti del colostro bovino mediante uso di modelli transgenici 185 4.3.1. Introduzione 185 4.3.2. Materiale e Metodi 185 4.3.3. Risultati 188 4.3.4. Discussione e Conclusioni 192 4.4. Sperimentazione 4 Studio preliminare sulla risposta immunitaria innata indotta da Staphylococcus aureus 194 4.4.1. Introduzione 194 4.4.2. Materiale e Metodi 196 4.4.3. Risultati 201 4.4.4. Discussione e Conclusioni 207 4.5. Sperimentazione 5 Valutazione della risposta immunitaria mediante quantificazione citochinica in soggetti persistentemente infetti da Virus della Diarrea Virale Bovina (BVDV) 209 4.5.1. Introduzione 209 4.5.2. Materiale e Metodi 211 4.5.3. Risultati 214 4.5.4. Discussione e Conclusioni 216 III 4.6. Sperimentazione 6 Variazioni della citomorfologia e dell'espressione genica di alcune citochine in corso di RAO sperimentalmente indotta in cavallo sportivo 218 4.6.1. Introduzione 218 4.6.2. Materiale e Metodi 219 4.6.3. Risultati 229 4.6.4. Discussione e Conclusioni 238 4.7. Sperimentazione 7 Valutazione di marker in corso di setticemia dei puledri 240 4.7.1. Introduzione 240 4.7.2. Materiale e Metodi 240 4.7.3. Risultati 243 4.7.4. Discussione e Conclusioni 245 4.8. Sperimentazione 8 La parvovirosi canina come modello di sepsi 247 4.8.1. Introduzione 247 4.8.2. Materiali e Metodi 249 4.8.3. Risultati 260 4.8.4. Discussione e Conclusioni 271 5. CONCLUSIONI FINALI 275 6. BIBLIOGRAFIA 276 IV 1 INTRODUZIONE Le citochine sono molecole proteiche prodotte da vari tipi di cellule e secrete in risposta ad uno stimolo. Esse sono in grado di modificare il comportamento di altre cellule inducendo attività quali crescita, differenziamento e apoptosi. Negli ultimi anni anche in campo veterinario è stata rivolta particolare attenzione al ruolo che questi fattori rivestono; tali proteine sono in grado di agire come segnali di comunicazione intercellulare nell’immunità, nella riparazione cellulare e nell’ematopoiesi. Ad oggi sono state identificate numerose citochine e una loro maggior comprensione in ambito fisiologico, patologico e terapeutico rappresenta un argomento di ricerca interessante. In particolare il blocco della produzione di citochine, l’inibizione o la catalizzazione del legame al rispettivo recettore e l’inibizione del meccanismo di trasduzione del segnale potrebbero rappresentare innovative strategie terapeutiche. La seguente tesi si pone quale obiettivo la comprensione del ruolo svolto da tali mediatori in corso di patologie naturali o sperimentalmente indotte. In particolare è stata valutata l’espressione genica e in alcuni casi proteica di un vasto panel di citochine in animali da sperimentazione, da affezione e da reddito indagando il loro coinvolgimento in corso di svariate situazioni fisiopatologiche e partendo da diverse matrici. Considerando l’eterogeneità di materiali impiegati nelle diverse ricerche, si è avuto modo di mettere a punto molteplici metodiche e protocolli di estrazione di materiale genico e proteico. Differenti e numerose sono state pure le metodologie d’indagine applicate su tale materiale: Real Time PCR, citometria a flusso, metodiche ELISA, metodiche di sequenziamento e allineamento genomico e l’uso di colture di linfociti e di cellule derivanti da midollo osseo applicandole sia in virologia che in batteriologia. L'applicazione di queste metodiche all'espressione citochinica potrà portare all'acquisizione di maggiori informazioni riguardo la risposta immunitaria attuata in diverse patologie animali, contribuendo a chiarirne i meccanismi patogenetici. 2 PARTE GENERALE 3 1. RISPOSTA IMMUNITARIA ED INFIAMMAZIONE La risposta immunitaria rappresenta l’azione coordinata di numerose cellule, tessuti e loro prodotti solubili volta a riconoscere, attaccare e distruggere ciò che è “estraneo” all’organismo. Le strutture non self sono definite antigeni e comprendono agenti infettivi (batteri, virus, parassiti, miceti), materiali inerti ed elementi generati dall’ospite stesso quali le cellule neoplastiche. I vertebrati sono capaci di due tipi di risposta immunitaria: innata ed acquisita. La risposta immunitaria innata (o naturale) rappresenta il primo argine di difesa contro diversi tipi di insulto ed è il sistema di difesa filogeneticamente più antico che si ritrova in tutti gli organismi pluricellulari, compresi le piante e gli insetti, mentre la risposta immunitaria acquisita (o specifica) compare per la prima volta nei vertebrati, e si rende complementare ai meccanismi dell’immunità innata al fine di potenziare la protezione dell’ospite nei confronti dei patogeni esterni (Abbas et al., 2000). Entrambe le risposte sono in grado di distinguere strutture self e non self, ma il grado di specificità e i meccanismi che sottostanno al riconoscimento dell’entità non-self sono diversi. La risposta immunitaria innata si realizza rapidamente ogni volta che un agente esterno entra in contatto con l’organismo e il processo che viene messo in atto avviene in due fasi: una prima fase è caratterizzata dall’azione di elementi non specifici e non inducibili dell’ospite, quali barriere anatomiche e fisiologiche che operano in maniera passiva, ma costante, per impedire l’ingresso degli agenti estranei. La seconda fase è invece caratterizzata dall’azione di elementi effettori, dotati di recettori in grado di riconoscere un numero limitato di pattern molecolari comuni alla maggior parte dei patogeni, che danno il via a meccanismi di difesa che nel loro insieme vengono definiti con il termine di “infiammazione” (Mak et Saunders, 2006). L’infiammazione, o flogosi, è la risposta dei tessuti vascolarizzati dell’organismo ad un insulto locale che comprende una serie di alterazioni nel letto vascolare, nel sangue e nel tessuto connettivo che sono preposte all’eliminazione dell’insulto e alla riparazione del tessuto danneggiato. L’infiammazione è un processo che coinvolge diversi tipi cellulari, fattori umorali e tissutali e prende avvio a seguito di un danno di cellule o tessuti conseguente ad infezioni (batteri, virus, parassiti, miceti), azione di sostanze chimiche, fattori fisici, alterazioni immunitarie e neoplasie. Nonostante sia stata ideato come meccanismo di difesa, il processo flogistico, se si realizza in maniera inappropriata, può condurre a profonde alterazioni sistemiche, determinando danni tissutali più gravi di quelli prodotti dall’insulto originario (Gruys et al., 2005). In aggiunta, i prodotti derivanti dal danneggiamento tissutale, quali le cellule necrotiche, contribuiscono al perpetuarsi della risposta infiammatoria in maniera sproporzionata (Bochsler et Slauson, 2002). La risposta immunitaria acquisita comprende meccanismi di riconoscimento ed effettori che sono altamente specifici per un preciso agente eziologico che ha dato il via alla risposta. Gli antigeni si legano in maniera specifica a recettori presenti sui linfociti T e B, i quali, assieme agli anticorpi da loro prodotti, riconoscono un numero potenzialmente illimitato di target, ma non agiscono in maniera immediata. I linfociti e i loro prodotti specifici persistono come “memoria immunitaria” e diventano rapidamente proteggenti in caso di riesposizione allo stesso agente. Entrambe le risposte immunitarie, innata ed acquisita, devono funzionare correttamente affinché la difesa verso agenti esterni sia efficace. L’utilità della risposta innata non è limitata al “tamponamento” dell’insulto nell’attesa dello sviluppo e del potenziamento della risposta acquisita: in alcuni casi l’immunità innata riesce a controllare la noxa patogena ed è fondamentale per l’induzione della risposta acquisita, grazie alla produzione di diversi fattori, 4 quali molecole messaggere chiamate citochine. Dal canto suo la risposta immunitaria specifica può essere intesa come un’estensione più sofisticata della risposta innata, dato che il complesso del riconoscimento e le azioni delle cellule della memoria (così dette perché mantengono nel tempo la specificità per l’antigene) inducono molti degli effetti impiegati dalle cellule del sistema innato per la rimozione dei diversi tipi di insulto (Mak e Saunders, 2006). 5