Alma Mater Studiorum Università degli Studi di Bologna DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE BIOMEDICHE XXVI Ciclo Settore Scientifico Disciplinare: MED/15- Malattie del Sangue Settore Concorsuale di afferenza: 06/D3 Malattie del sangue, Oncologia e Reumatologia LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE E SIGNALING PURINERGICO: POSSIBILI SVILUPPI TERAPEUTICI Relatore: Presentata da: Dr.ssa Dr.ssa LUCIA CATANI VALENTINA SALVESTRINI Coordinatore del corso di Dottorato: Prof. LUCIO COCCO Esame finale anno 2014 1 Indice 2 SOMMARIO 7 INTRODUZIONE I. SISTEMA EMOPOIETICO 1. L’emopoiesi 10 2. La cellula staminale 14 3. La nicchia 16 II. LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA 1. La leucemia mieloide acuta 19 2. La cellula staminale leucemica 23 3. La nicchia leucemica 28 III. NUCLEOTIDI EXTRACELLULARI E RECETTORI P2 1. I nucleotidi ATP e UTP 31 2. I recettori purinergici 33 3. Signaling purinergico e sistema emopoietico 36 4. Signaling purinergico e cancro 38 MATERIALI E METODI 1. Cellule 43 2. Arricchimento di progenitori emopoietici normali CD34+ mediante separazione immunomagnetica 45 3. Isolamento di cellule staminali leucemiche mediante cell sorting 46 4. Quantificazione dell’espressione dell’mRNA dei P2R mediante Real-time qRT-PCR 47 3 5. Analisi degli ioni Calcio intracitoplasmatici 51 6. Studi di microarrays 52 7. Saggi clonogenici 53 8. Saggi di proliferazione 54 9. Apoptosi 55 10. Ciclo cellulare 56 11. Saggi di migrazione 57 12. Esperimenti di xenotrapianto 58 13. Analisi statistica dei dati 62 RISULTATI 1. Le cellule leucemiche di LAM esprimono i recettori purinergici P2 64 2. I recettori P2 espressi dalle cellule di LAM sono funzionalmente attivi 66 3. GEP di cellule leucemiche trattate con ATP 69 4. L’ATP inibisce la proliferazione e la capacità clonogenica di cellule leucemiche 81 5. L’ATP esplica la sua funzione anti-proliferativa e pro-apoptotica attivando il recettore P2X7 86 6. Effetto inibitorio dei nucleotidi trifosfato sulla migrazione in vitro di cellule di LAM 90 7. I nucleotidi trifosfato inibiscono la capacità di homing ed engraftment delle cellule di LAM in topi immonocompromessi 94 4 8. Utilizzo farmacologico dell’ATP in vivo 97 DISCUSSIONE 101 BIBLIOGRAFIA 110 5 Sommario 6 I nucleotidi trifosfato sono, dal punto di vista evoluzionistico, tra le molecole più antiche e conservate tra le specie. Oltre al ruolo cruciale che ricoprono in alcune fondamentali funzioni cellulari come la sintesi degli acidi nucleici e il metabolismo energetico della cellula, negli ultimi trenta anni è emerso sempre di più il loro coinvolgimento nella regolazione di numerose funzioni cellulari. Questi importanti mediatori cellulari sono presenti nel microambiente e cambiamenti nella loro concentrazione extracellulare possono modulare in maniera differenziale vari tipi cellulari. Ad esempio, i nucleotidi trifosfato ATP e UTP, presenti nel microambiente midollare, sono dei potenti stimolatori dei progenitori emopoietici. Essi stimolano la proliferazione e l’attecchimento delle cellule staminali emopoietiche, così come la loro capacità migratoria, attraverso l’attivazione di specifici recettori di membrana, i recettori purinergici (P2R). In questo studio abbiamo dimostrato che i nucleotidi ATP e UTP esercitano un effetto diametralmente opposto sul compartimento staminale leucemico di leucemia acuta mieloide (LAM). Abbiamo dimostrato che le cellule leucemiche esprimono i recettori P2 e che questi sono funzionalmente attivi. Studi di microarray hanno evidenziato che, a differenza di ciò che avviene nelle CD34+, la stimolazione di cellule leucemiche con ATP induce la down-regolazione dei geni coinvolti nella proliferazione e nella migrazione, mentre up-regola geni inibitori del ciclo cellulare. Abbiamo poi confermato a livello funzionale, mediante test in vitro, gli effetti osservati a livello molecolare. Studi di inibizione farmacologica, ci hanno permesso di capire che l’attività inibitoria dell’ATP 7 sulla proliferazione si esplica attraverso l’attivazione del recettore P2X7, mentre i sottotipi recettoriali P2 prevalentemente coinvolti nella regolazione della migrazione sono i recettori P2Y2 e P2Y4. Esperimenti di xenotrapianto, hanno evidenziato che l’esposizione ad ATP e UTP sia dei blasti leucemici sia delle cellule staminali leucemiche CD38-CD34+ diminuisce la loro capacità di homing e di engraftment nel midollo di topi immunocompromessi. Inoltre, il trattamento farmacologico con ATP, di topi ai quali è stata indotta una leucemia umana, ha diminuito lo sviluppo della leucemia in vivo. Nel complesso i dati riportati in questo studio dimostrano la capacità dei nucleotidi ATP e UTP di modulare la funzionalità cellulare di cellule di LAM. In particolare, l’attivazione del signaling purinergico da parte di ATP e UTP, a differenza di ciò che accade nelle CD34+ normali, inibisce la proliferazione, la migrazione e l’attecchimento in vivo. Questo ci porta a pensare che la modulazione farmacologica del signaling purinergico possa rappresentare un buon punto di partenza per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. 8 Introduzione 9 I. IL SISTEMA EMOPOIETICO 1. L’emopoiesi L’emopoiesi è il processo attraverso il quale hanno origine progenitori maturi e cellule differenziate dei vari lineage differenziativi mieloide, eritroide, megacariocitario e linfoide, a partire da una popolazione di cellule staminali capostipiti. Il sistema emopoietico è un sistema altamente gerarchizzato, con differenti progenitori committed dotati di differenti capacità proliferative e differenziative (vedi figura 1). Figura 1. Albero differenziativo delle cellule emopoietiche 10