ALMA MATER STUDIORUM UNITERSITA’ DI BOLOGNA FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI Corso di laurea magistrale in BIOLOGIA MARINA COMPETIZIONE E INTERAZIONI ALLELOPATICHE TRA OSTREOPSIS OVATA E ALTRE MICROALGHE Tesi di laurea in Biologia Marina Relatore Presentata da Prof.ssa Rossella Pistocchi Loretta Antoni Correlatore: Dott.ssa Franca Guerrini III sessione Anno Accademico 2010/2011 I II Ad Augusta, Elsa e Tatiana Ai cari compagni di viaggio che hanno compiuto il loro cammino III IV INDICE 1 INTRODUZIONE ………………………………………………………...1 1.1 FIORITURE ALGALI …………………………………………………...2 1.1.1 Caratteristiche generali di una fioritura ………………………… 2 1.1.2 Fioriture algali dannose ………………………………………… 5 1.1.3 Le tossine algali ………………………………………………….7 1.2 ALLELOPATIA ……………………………………………………… 14 1.2.1 I composti allelopatici ……………………………………….. 17 1.2.2 Effetti allelopatici ……………………………………………. 19 1.3 GENERALITA’ SU DINOFLAGELLATA ………………………….. 21 1.3.1 OSTREOPSIS OVATA ……………………………………….. 24 1.3.1.1 Una microalga nella cronaca ………………………… 24 1.3.1.2 Morfologia di Ostreopsis ovata …………………….. 26 1.3.1.3 Parametri ambientali ………………………………… 27 1.3.1.4 Tossicità di Ostreopsis e gestione del rischio ……….. 28 1.3.2 PROROCENTRUM LIMA ……………………………………. 34 1.3.2.1 Inquadramento tassonomico …………………………. 35 1.3.2.2.Tossicità e allelopatia di P. lima …………………….. 36 2. SCOPO DELLA TESI ………………………………………………… 39 3 MATERIALI E METODI ……………………………………………... 41 3.1 CEPPI UTILIZZATI ………………………………………………….. 41 3.2 PREPARAZIONE DELL’ACQUA DI MARE ………………………. 41 3.3 PREPARAZIONE DEL TERRENO DI COLTURA ………………… 42 V 3.4 PRIMO CICLO DI ACCLIMATAZIONE ………………………… 43 3.5 SECONDO CICLO DI ACCLIMATAZIONE ……………………. 45 3.6 INOCULI ………………………………………………………….. 46 3.7 RACCOLTA DELLE MICROALGHE …………………………… 48 3.8 ESTRAZIONE DELLE TOSSINE ………………………………… 49 3.9 ANALISI DEI NUTRIENTI ………………………………………. 50 3.9.1 Determinazione dei nitrati ……………………………………. 50 3.9.2 Determinazione del fosforo reattivo ………………………….. 54 3.10 Fluorimetria ad ampiezza di impulsi modulata…………………… 56 3.11 CONTEGGI E MISURE…………………………………………… 61 3.11.1 Conteggi……………………………………………………… 61 3.11.2 Calcolo del tasso di crescita ………………………………… 61 3.11.3 Calcolo dei biovolumi ………………………………………. 62 4 RISULTATI E DISCUSSIONE …………..……………………….. 64 4.1 Osservazioni al microscopio ottico – forma e dimensioni……… 64 4.2 Curve e tassi di crescita…………………………………………. 72 4.3 Utilizzo dei nutrienti……………………………………………. 76 4.4 Risposte alla luce……………………………………………….. 78 4.5 Risposte alla variazione di temperatura…………………………. 82 4.6 Tossicità e allelopatia…………………………………………… 85 5 CONCLUSIONI ……………………………………………………. 88 6 BIBLIOGRAFIA ……………………………………………………. 90 RINGRAZIAMENTI…………………………………………………...104 VI 1. INTRODUZIONE Il fitoplancton costituisce la componente autotrofa fotosintetica degli organismi che galleggiano liberamente e passivamente in acque dolci e marine. L’insieme di queste specie microscopiche, con dimensioni comprese tra 0,2 µm e 2000 µm, assume un ruolo fondamentale nel trasferimento di energia ai livelli trofici superiori, facendosi carico della maggior parte della produzione primaria in ambiente marino, e svolgendo un importante ruolo nei cicli del carbonio, dell’azoto, del fosforo, dell’ossigeno con ripercussioni sugli ecosistemi locali e su tutto il pianeta, in modo analogo al lavoro compiuto in terra ferma da parte della vegetazione terrestre. Al fitoplancton appartengono organismi procarioti, quali i cianobatteri, ed eucarioti di molti gruppi tassonomici, quali Bacillariophyceae, Dinophyceae, Chlorophyceae, Xanthophyceae, Cryptphyceae, Chrysophyceae, Aptophyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae. Sono comprese specie unicellulari, pluricellulari, coloniali di varia dimensione, morfologia ed ecologia, suddivisi anche evolutivamente in base alla struttura dei cloroplasti, raggiunta a seguito di processi d’endosimbiosi primaria e secondaria e in base alla presenza di particolari pigmenti fotosintetici. Certi gruppi, come Diatomee, Dinoflagellate e altri, in particolari periodi dell’anno e in determinate condizioni legate a vari fattori quali luce, temperatura, condizioni meteorologiche e moto ondoso, concentrazione di nutrienti, presenza/assenza di predatori e/o competitori, attivazione di forme quiescenti, possono raggiungere un numero molto elevato di cellule per litro, fenomeno che già di per sé può provocare effetti negativi, quali alterazioni nel colore delle acque, odori sgradevoli, fino a morìe di fauna acquatica specialmente per anossia. In aggiunta, durante questi fenomeni di fioriture algali, o blooms, alcune specie producono e immettono nelle acque sostanze tossiche, prodotte anche quando la concentrazione di cellule per litro non è elevatissima. Queste tossine, rilasciate nelle acque, possono accumularsi nei tessuti degli organismi filtratori, amplificandosi lungo la catena trofica, fino ad arrecare danni all’uomo, quale consumatore finale (Fiocca e Vadrucci, 2009). Un ruolo importante nella struttura e nella successione delle popolazioni di fitoplancton è attribuito anche a interazioni allelopatiche che avvengono tra specie di microalghe marine (Arzul e Gentien, 2006), tramite emissione di agenti chimici spesso diversi dalle tossine. 1 La sensazione che i blooms siano aumentati in frequenza ed estensione geografica in risposta ad attività antropiche ha aumentato l’interesse sulla loro ecologia nell’ultimo decennio, coinvolgendo non solo la comunità scientifica, ma anche l’opinione pubblica e le autorità (Granéli e Turner, 2006). I fenomeni HAB’s (Harmfu Algal Blooms) sono segnalati sempre in maggior numero (Smayda, 1990) e viene attribuita molta responsabilità alle cause antropiche, quali la crescente eutrofizzazione con l’incremento dell’input di nutrienti quali N e P, spesso associato a una diminuzione di silicio a scapito delle diatomee; attività di acquacoltura e maricoltura hanno un ruolo potenziale nello sviluppo di HAB causa produzione di feci e prodotti di escrezione ricchi in azoto e fosforo (Sellner et al., 2003). Analoga responsabilità nella formazione dei bloom deve però essere attribuita agli eventi naturali. Movimenti delle acque dovuti a tempeste, aumento degli scarichi fluviali causa le piogge, miscelazione degli strati profondi ricchi in nitrati verso le acque superficiali a causa del vento, il quale induce anche l’upwelling costiero, formazione e mantenimento di stratificazioni, trasporto di popolazioni fitoplanctoniche attraverso i grandi sistemi di correnti nella circolazione dei bacini oceanici, sono esempi di cause indipendenti da azioni dell’uomo (Sellner et al., 2003). Anche eventi meteorologici su larga scala, quali El Niño, possono portare alla formazione di fioriture (Franks, 1997b). 1.1 FIORITURE ALGALI 1.1.1 Caratteristiche generali di una fioritura Quando una popolazione di microalghe trova condizioni idonee alla sua crescita, può aumentare enormemente e in breve tempo la sua densità cellulare, determinando quello che viene chiamato un bloom. Nell’aspetto fisico direttamente visibile, una fioritura può manifestarsi con colorazione delle acque rossa, da cui il nome tradizionale di “maree rosse”, oppure bruna, verde o altro a seconda della specie che l’ha prodotta e della sua fase di crescita, mentre si possono notare filamenti, fronti mucillaginosi o masse più disperse (Fukuyo, 2006; Corsini et al., 2008) (Fig. 1). Si tratta di un fenomeno descritto da tempo: già Darwin durante il viaggio del Beagle aveva osservato una verosimile fioritura di dinoflagellate in Cile (Granéli e Turner, 2006). 2 Fig. 1. Bloom algale al largo delle coste argentine (da Tredici, 2006, modificata) (http://oceancolor.gsfc.nasa.gov/SeaWiFS/). Le fioriture possono coprire un’area di 0,0005-1,36 chilometri quadrati e permanere pochi giorni o anche mesi. Se ne osservano circa 200 all’anno. Nell’acqua di una fioritura si ritrova una sola specie, della quale si possono contare anche decine di migliaia di cellule per millilitro (Fukuyo, 2006). Una fioritura passa sempre attraverso una fase d’inizio, quindi di crescita e mantenimento e infine di dispersione (Steidinger e Garcés, 2006). L’inizio di una fioritura può dipendere da una complessità di fattori, che comprendono la natura della specie interessata, la sua biologia, il suo ciclo vitale, le interazioni con le altre specie, le variazioni di temperatura e salinità, del clima, la disponibilità di nutrienti. Il fenomeno è influenzato anche dalle attività antropiche, dall’eccessiva urbanizzazione, dal sovrasfruttamento delle risorse ittiche, dal trasferimento di specie da una zona all’altra. Spesso non ci sono dati sulle condizioni che precedono il bloom e lo sviluppo di modelli per prevederli includendovi parametri quali la cinetica nell’uptake dei nutrienti, il tasso di predazione, il tasso di crescita della specie (Cembella, 1998), non ha ancora raggiunto una buona attendibilità. Come per i modelli meteorologici, la cui capacità di previsione non va oltre un breve periodo, soprattutto a causa degli effetti di processi irrisolti nella condizione iniziale, così l’abilità 3 predittiva di un modello che accoppia parametri biologici e fisici non può che essere limitata, anche in considerazione del fatto che molte fioriture sono fortemente influenzate dalle condizioni meteorologiche stesse (vento, soleggiamento) (Franks, 1997a). Per quanto riguarda il ruolo delle sostanze allelopatiche nella dinamica di formazione delle fioriture, studi di allelopatia in meta analisi hanno indicato che, a parte qualche eccezione, gli effetti allelopatici sono significativi solo in condizioni di alta densità cellulare, ma non alle densità che precedono il bloom, sollevando dubbi sul ruolo dell’allelopatia come meccanismo d’inizio delle fioriture stesse (Jonsson et al., 2009). Suikkanen et al. (2004), in uno studio sul ruolo ecologico delle sostanze allelochimiche in cianobatteri del Mar Baltico, suggeriscono che la loro funzione è quella di mantenere la dominanza delle popolazioni nella comunità, solo dopo però che si è venuta a formare in precedenza una certa concentrazione di cellule a causa di fattori ambientali. Meglio conosciuti sono i fattori che influenzano le fasi di mantenimento della fioritura e quelli che portano alla sua senescenza e alla dissipazione. La dissipazione del bloom può avvenire per auto-ombreggiamento e competizione intraspecifica per i nutrienti, dispersione tramite trasporto causa le correnti, predazione, malattie passaggio a forme di vita quiescente, quali le cisti (Burkholder et al., 2006). I processi allelopatici sembrano invece avere influenza sulla successione delle specie fitoplanctoniche e sul mantenimento delle fioriture algali (Pratt, 1966; Rengefors e Legrand, 2001; Wolfe, 2000), essi sono probabilmente implicati nella quasi monospecificità dei blooms (Arzul e Gentien, 2006). Per chiarire questo concetto, si citano alcuni esempi. Nel 1987, lungo la costa atlantica francese, dove precedenti osservazioni avevano mostrato una predominanza della diatomea Chaetoceros sp., un massiccio sviluppo di Karenia mikimotoi (alias Gyrodinium cf. aureolum), che si è esteso rapidamente uccidendo molta della fauna marina, in due giorni ha raggiunto il 95% della popolazione algale, dominandola, con una densità di oltre 300.000 cellule per litro (Gentien e Arzul, 1990). Analisi di laboratorio hanno poi rivelato la presenza di sostanze allelochimiche inibitrici della crescita della diatomea. In Cile, una fioritura di Gymnodinium sp., associata a moria di fauna marina, mostrava nelle aree di maggiore concentrazione una dominanza del 99,9% e una densità di 4-8 milioni di cellule per litro. Le zone di fioritura più intensa si sono poi estese e spostate a causa delle correnti. La fioritura è collassata nel periodo delle maree primaverili, quando si è mescolata con masse d’acqua a bassa 4