Alice Heidrich Prompt ANÁLISE DA FERMENTAÇÃO DE GLICOSE E XILOSE POR LEVEDURAS Spathaspora ISOLADAS DE MADEIRA EM DECOMPOSIÇÃO Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal de Santa Catarina visando à obtenção do grau de Mestre em Bioquímica. Orientador: Prof. Dr. Boris Ugarte Stambuk. Florianópolis 2012 Alice Heidrich Prompt ANÁLISE DA FERMENTAÇÃO DE GLICOSE E XILOSE POR LEVEDURAS Spathaspora ISOLADAS DE MADEIRA EM DECOMPOSIÇÃO Esta dissertação foi julgada adequada para obtenção do título de Mestre em Bioquímica e aprovada em sua forma final pelo programa de Pós- Graduação em Bioquímica. Florianópolis, 27 de Novembro de 2012. _________________________ Prof. Dr. Boris Ugarte Stambuk. Coordenador do curso de Pós-Graduação em Bioquímica. Banca examinadora: _________________________ Prof. Dr. Márcio José Rossi MIP/CCB/UFSC _________________________ Prof. Dr. Alcir Luiz Dafré BQA/CCB/UFSC _________________________ Prof. Dr. Carlos Peres Silva BQA/CCB/UFSC AGRADECIMENTOS Agradeço ao professor Dr. Boris U. Stambuk, pela sua orientação, paciência, e, sobretudo pela oportunidade a mim concedida de fazer parte de sua equipe de laboratório. Ao professor Dr. Sérgio Alves Júnior, por me ajudar e passar seus conhecimentos no início do meu trabalho. À colega de laboratório e amiga Adriane Mouro, que muito me ensinou e nunca se negou a me ajudar sempre que precisei. Agradeço também à Drª Maria de Lourdes Magalhães, que contribuiu muito para minha formação. Aos demais amigos e colegas de laboratório Ana, Augusto, Belisa, Catarina, Daniella, Davi, Débora, Francisco, Gabriela, Marília, Marcelo, Mylena e Victor pelas conversas, companhia, contribuições e amizade durante o tempo de trabalho. A minha família, mãe, pai, irmãs, sobrinhos. Sem eles nada disso seria possível. À minha sogra, pelo apoio a mim dado durante esse tempo. Ao meu amor, namorado e melhor amigo Pedro. Pelo seu amor, companheirismo, carinho, dedicação e, principalmente, pela paciência. Por sempre ter me apoiado em todas as minhas escolhas e nunca ter se negado a me ajudar no que fosse preciso. Às minhas amigas de Porto Alegre, que são essenciais em minha vida. Pelo carinho e momentos de descontração que passamos durante o tempo desse trabalho. A Nádia, que se tornou uma grande amiga neste período do meu trabalho. Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica pelo apoio e esclarecimento prestado durante o curso. Ao laboratório do professor Alcir, por disponibilizar alguns de seus equipamentos. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina (FAPESC), e Agência de Cooperação Internacional do Japão (JICA) pela bolsa de mestrado e apoio financeiro para o desenvolvimento deste trabalho. RESUMO A crescente preocupação com o futuro esgotamento dos combustíveis fósseis tem impulsionado o desenvolvimento de novas tecnologias para produção de combustíveis alternativos como o etanol. O etanol de segunda geração é dependente da fermentação dos açúcares que constituem a biomassa lignocelulósica, composta por lignina, celulose e hemicelulose. A hemicelulose é composta tanto por hexoses como por pentoses. A xilose é a pentose predominante na lignocelulose, e o segundo açúcar mais abundante na natureza. A levedura Saccharomyces cerevisiae, principal microrganismo utilizado na produção de etanol de primeira geração, é incapaz de fermentar essa pentose. Por essa razão, pesquisas para identificar novas leveduras capazes de fermentar a xilose têm enorme aplicação biotecnológica. Neste trabalho foram analisadas 42 linhagens de leveduras, isoladas de madeira em decomposição na biodiversidade brasileira, como possíveis leveduras fermentadoras de xilose. Entre essas leveduras, quatro novas espécies fermentadoras de xilose foram classificadas e denominadas Spathaspora brasiliensis, Spathaspora roraimanensis, Spathaspora suhii, e Spathaspora xylofermentans. Essas diferentes leveduras Spathaspora apresentaram diferentes rendimentos na produção de etanol quando crescidas em meios contendo xilose ou glicose como fonte de carbono, quando fermentam em sistema de batelada misturas de xilose e glicose, ou hidrolisados enzimáticos de bagaço de cana-de-açúcar. Nossos resultados indicam que as espécies S. roraimanensis, S. xylofermentans e as já conhecidas S. passalidarum e S. arborariae, apresentam os melhores rendimentos na produção de etanol durante a fermentação de xilose. Finalmente, analisamos a expressão relativa de genes, presentes no genoma da levedura S. arborariae, possivelmente envolvidos na metabolização de xilose. Nossos resultados mostraram uma maior expressão relativa de 4 genes (que codificam para as enzimas xilose redutase e xilulocinase, e dois transportadores de xilose) nas células cultivadas em xilose, quando comparado com células crescidas em glicose. Estes novos genes constituem interessantes alvos para, através de engenharia genética, otimizar a produção de etanol a partir de hidrolisados da biomassa lignocelulósica. Palavras-chave: xilose, Spathaspora, lignocelulose, bioetanol. ABSTRACT Growing concerns with the future depletion of fossil fuels has driven the development of new technologies for the production of alternative fuels like ethanol. Second generation ethanol depends on the fermentation of sugars from lignocellulosic biomass, composed of lignin, cellulose and hemicellulose. Hemicellulose contains both hexoses and pentoses. Xylose is the predominant pentose in lignocellulose, and the second most abundant sugar in nature. The yeast Saccharomyces cerevisiae, the major microorganism used in the production of first generation ethanol, is unable to ferment this pentose. Therefore, studies aiming the identification of new yeasts capable of fermenting xylose have several biotechnological applications. In this work we analyzed 42 yeast strains isolated from decaying wood in the Brazilian biodiversity as possible xylose-fermenting yeasts. Among these yeasts, four new xylose fermenting species were classified and named Spathaspora brasiliensis, Spathaspora roraimanensis, Spathaspora suhii, and Spathaspora xylofermentans. These different Spathaspora yeasts presented different ethanol yields when grown in media containing glucose or xylose as carbon source, during batch fermentations with glucose and xylose mixtures, or with sugarcane bagasse enzymatic hydrolysates. Our results indicate that the species S. roraimanensis, S. xylofermentans and the already known S. passalidarum and S. arborariae, show the best yields in ethanol production during xylose fermentation. Finally, we determined the relative expression of genes, present in the genome of the yeast S. arborariae, possibly involved in the metabolism of xylose. Our results showed a higher relative expression of four genes (encoding the enzymes xylose reductase and xyluloquinase, and two xylose transporters) in cells grown on xylose, as compared to cells grown in glucose. These new genes are interesting targets for optimizing, through genetic engineering, the production of ethanol from lignocellulosic biomass hydrolysates. Keywords: xylose, Spathaspora, lignocellulose, bioethanol.