ALEXANDRE GOMES RODRIGUES APLICAÇÃO DE FUNGOS DE MANGUEZAIS NA OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA COM AÇÃO ANTIMICROBIANA Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção de Título de Mestre em Biotecnologia. São Paulo 2013 ALEXANDRE GOMES RODRIGUES APLICAÇÃO DE FUNGOS DE MANGUEZAIS NA OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA COM AÇÃO ANTIMICROBIANA Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção de Título de Mestre em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia Orientadora: Profa. Dra. Ana Olívia de Souza Versão original São Paulo 2013 DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo reprodução não autorizada pelo autor Rodrigues, Alexandre Gomes. Aplicação de fungos de manguezais na obtenção de nanopartículas de prata com atividade antimicrobiana / Alexandre Gomes Rodrigues. - - São Paulo, 2013. Orientador: Profa. Dra. Ana Olívia de Souza. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/IPT/Instituto Butantan. Área de concentração: Biotecnologia. Linha de pesquisa: Nanobiotecnologia. Versão do título para o inglês: Application of mangrove fungi in obtaining silver nanoparticles with antimicrobial activity. 1. Fungos 2. Manguezal 3. Nanopartículas de prata 4. Atividade antibacteriana 5. Atividade antifúngica I. Souza, Profa. Dra. Ana Olívia de II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/IPT/Instituto Butantan III. Título. ICB/SBIB0139/2013 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia Universidade de São Paulo, Instituto Butantan, Instituto de Pesquisas Tecnológicas ______________________________________________________________________________________________________________ Candidato(a): Alexandre Gomes Rodrigues. Título da Aplicação de fungos de manguezais na obtenção de nanopartículas de prata com atividade antimicrobiana. Orientador(a): Profa. Dra. Ana Olívia de Souza. A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado, em sessão pública realizada a ................./................./................., considerou ( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a) Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................ Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................. Presidente: Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................ A todas as pessoas que passaram por minha vida, levando um pouco de mim e deixando um pouco de si. AGRADECIMENTOS À Profa. Dra. Ana Olívia de Souza por aceitar me orientar, pela dedicação, paciência, amizade, empenho e interesse no desenvolvimento do trabalho. À minha família que sempre me apoiou e compreendeu minhas ausências. À Yu Ping Liu pela amizade, importante colaboração em muitos momentos, especialmente na identificação dos fungos, pela presteza e carinho, e também pelas comidas chinesas. À Orlando Giarletti pela amizade, paciência, discussões e contribuições que muito, e sempre ajudaram a enriquecer meu modo de pensar, e pelas poucas partidas de ping pong. À Rafael Marques Porto pela amizade sempre enriquecedora e pelas longas e boas conversas. À Profa. Dra. Adriana Rios pela constante disponibilidade, pelo carinho e gentileza. Ao Prof. Dr. Daniel Pimenta pelas conversas e disposição em dar opiniões pertinentes. À Profa. Dra. Lujbica Tasic pela colaboração nos experimentos de caracterização das proteínas e discussões enriquecedoras. Ao Dr. Itamar Soares Melo por fornecer as cepas dos fungos de mangue e se mostrar sempre prestativo e atencioso. Ao Dr. Ivo Lebrun por me acolher no Laboratório de Bioquímica e Biofísica. À Profa. Dra. Rita Ruiz pela colaboração nos experimento de atividade antibacteriana. À Profa. Dra. Priscyla D. Marcato pela colaboração nos experimentos de Microscopia Eletrônica e pela ajuda sempre que possível. Aos professores Wellington Luiz de Araújo, Maria Filomena de Andrade Rodrigues e Paulo Roberto Regazi Minarini pela participação no Exame de Qualificação, com valiosas contribuições. Aos funcionários da secretaria do Programa de Pós Graduação, que sempre estiveram à disposição e sempre ajudaram de todas as formas. À CAPES pelo importante apoio financeiro. Assim como a FAPESP pelo apoio financeiro ao projeto. Silêncio um pequeno sorriso que salta da monotonia para tornar a vida uma cena diferente daquele dia repetido um novo modo de olhar separando os verbos das velhas flores e manias que assustam a vida de uma alma inquieta. Sasha Y. Dichter RESUMO RODRIGUES, A. G. Aplicação de fungos de manguezais na obtenção de nanopartículas de prata com ação antimicrobiana. 2013. 106 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2013. Infecções hospitalares constituem um problema de saúde pública em países não desenvolvidos. Considerando a gravidade e consequências das infecções hospitalares, vestimentas hospitalares e materiais médicos que proporcionem a eliminação ou redução da presença de microrganismos têm sido estudados. A prata (Ag+) é um metal que apresenta ação antimicrobiana de amplo espectro e limitada toxicidade em humanos. Na forma de nanopartícula tem maior reatividade devido ao aumento da superfície de contato. Nanopartículas de prata (NP Ag) podem ser obtidas por métodos químicos e físicos, porém com uso de reagentes tóxicos e grande consumo de energia. Métodos biológicos representam uma alternativa para obter nanoparticulas metálicas. Neste trabalho quatorze linhagens de fungos isolados de mangue foram avaliadas quanto ao potencial de síntese de NP Ag com atividade antimicrobiana. Os fungos foram cultivados sob agitação por 72 horas em meio líquido batata dextrose (BD). À biomassa foi adicionada água destilada estéril. Após 72 horas a suspensão foi filtrada. O filtrado fúngico (FF) foi utilizado para a síntese de NP Ag na presença de AgNO e dois fungos foram selecionadas para a continuidade do estudo. A 3 caracterização físico-química das nanopartículas foi realizada por espectrofotometria, microscopia eletrônica de transmissão e espectroscopia de correlação de fótons. A banda de plasmon na região de 440 nm evidenciou a formação de NP variando entre 10-30 nm. O potencial zeta foi positivo para as NP Ag de MGE-201 e negativo para NP de L-2-2. A presença e identificação de proteínas na dispersão de nanopartículas foram feitas por eletroforese em gel de poliacrilamida – dodecil sulfato de sódio (SDS – PAGE) e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC/MS). A análise das proteínas presentes no FF e na dispersão de nanopartículas de L-2-2 em SDS-PAGE revelou a presença de três e quatro bandas com massa molecular na faixa de 25 a 174 Da, respectivamente. No FF e dispersão de NP Ag de MGE-201 foram encontradas quatro bandas com massa molecular de 75 a 328 Da. Nove proteínas foram detectadas por LC/MS na dispersão de NP de MGE-201. A ação antimicrobiana das nanopartículas foi avaliada em oito espécies de Candida e em quatro bactérias. As nanopartículas foram mais efetivas nas espécies de C. guilhermondi, C. parapsilosis, P. aeruginosa e S. aureus com concentrações inibitórias mínimas variando de 0,015 a 0,132 µg/mL. A citotoxicidade foi avaliada em macrófagos J774 e em hepatócitos de ratos. NP Ag de L-2-2 e MGE-201 apresentaram IC de 5,5e 26 µg/mL 50 em macrófagos e de 26 e 17 µg/mL em hepatócitos, respectivamente. Tecidos de algodão e de poliéster foram impregnados com NP Ag e a porcentagem de impregnação determinada por plasma indutivamente acoplado (ICP) variou de 0,1 - 12,5%. A ação antifúngica dos tecidos impregnados foi testada em C. albicans ATCC 36802, C. glabrata IOC 4565 e C. parapsilosis IOC 4564 com inibição do crescimento dos patógenos na faixa de 68,41 – 97,91 %. Em E. coli e S. aureus a inibição do crescimento foi de 100% na concentração de 2,2 µg/mL. Os fungos codificados como L-2-2 e MGE-201 foram identificados como Bionectra ochroleuca e Aspergillus tubingensis, respectivamente. Palavras-chave: Fungos. Manguezal. Nanopartículas de prata. Atividade antibacteriana. Atividade antifúngica. ABSTRACT RODRIGUES, A. G. Application of mangrove fungi in obtaining silver nanoparticles with antimicrobial activity. 2013. 106 p. Masters thesis (Biotechnology) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2013. Hospital infections constitute a public health problem in undeveloped countries. Considering the severity and consequences of nosocomial infections, hospital clothing and medical devices that provide the elimination or reduction of microorganisms have been studied. Silver (Ag +) is a metal that has broad spectrum antimicrobial activity and limited toxicity in humans. In nanoparticles form silver has higher reactivity due to increased contact surface. Silver nanoparticles (Ag NP) can be obtained by chemical and physical methods, but with drawbacks such as the use of toxic reagents and large energy consumption. Biological methods represent an alternative to obtain metal nanoparticles. In this study fourteen strains of fungi isolated from the mangrove were evaluated regarded to their capacity to synthesize Ag NP with antimicrobial activity. The fungi were cultivated for 72 hours in potato dextrose liquid medium (PD). Distilled sterile water was added to the biomass. After 72 h the suspension was filtered. The fungal filtrate (FF) was used to synthesize silver nanoparticles in the presence of AgNO and two fungi were selected to continue the work. The 3 physicochemical characterization was performed by spectrophotometry, transmission electron microscopy and photon correlation spectroscopy. The plasmon band in the region of 440 nm evidenced the formation of nanoparticles ranging from 10-30 nm. The zeta potential was positive for Ag NP of MGE-201, and negative for NP L-2-2. The presence and identification of the proteins in the nanoparticles dispersion were performed by sodium dodecyl sulfate - polyacrilamide gel electrophoresis (SDS – PAGE) and Liquid Chromatography - Mass Spectrometry (LC/MS) analysis. The analysis of the proteins in the FF and in the NP dispersion by SDS – PAGE revealed the presence of three and four bands with mass ranging from 25-174 Da, respectively. In the FF and Ag NP dispersion of MGE-201 four bands ranging from 75-328 Da were found. Nine proteins were detected by LC/MS in MGE-201 nanoparticles dispersion. The antimicrobial activity of the nanoparticles was evaluated against eight Candida species and four bacteria. The NP were more effective against the C. guilhermondi, C. parapsilosis, P. aeruginosa e S. aureus especies with minimum inhibitory concentrations from 0.015 to 0.132 µg/mL (1.3 a 12 µM). The citotoxicity was evaluated on J774 macrophages and rat hepatocytes. Ag NP presented IC of 5.5 and 26 µg/mL in 50 macrophages and of 26 e 17 µg/mL in hepatocytes, respectively. Cotton and polyester fabrics were impregnated with Ag NP for one, two and four times, and the percentage of impregnation was determined by inductively coupled plasma (ICP), varying from 0.1 - 12.5%. The antifungal activity of the fabrics impregnated with Ag NP was tested against C. albicans ATCC 36802, C. glabrata IOC 4565 and C. parapsilosis IOC 4564, presenting inhibition from 68.41 – 97.91 %. Against E. coli and S. aureus the growth inhibition was of 100% in the concentration of 2.2 µg/mL. The L-2-2 and MGE-201 coded fungi were identified as Bionectra ochroleuca and Aspergillus tubingensis, respectively. Keywords: Fungi. Mangrove. Silver nanoparticles. Antibacterial activity. Antifungal activity.