Aus der Klinik für Diagnostische und Interventionelle Neuroradiologie Des Universitätsklinikums des Saarlandes Leiter: Prof. Dr. med. W. Reith Aktuelle experimentelle Entwicklungen endovaskulärer Therapien intrakranieller Aneurysmen Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors in Theoretischer Medizin der medizinischen Fakultät der Universität des Saarlandes 2013 vorgelegt von Diplom Biologin Désirée Ley (geb. Junk) geboren am 03.03.1981 in Neunkirchen/Saar, Deutschland Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Seite Abbildungen ...................................................................................................... 4 Tabellen ............................................................................................................ 5 Diagramme ........................................................................................................ 5 Materialien ......................................................................................................... 5 Abkürzungen ..................................................................................................... 7 1. Historischer Hintergrund und Zielsetzung der Arbeit ........................ 9 2. Zusammenfassung/ Abstract ............................................................ 11 2.1. Zusammenfassung ........................................................................... 11 2.2. Abstract ............................................................................................ 13 3. Einleitung .......................................................................................... 15 3.1. Theoretischer Teil ............................................................................. 15 3.1.1. Aneurysmen ..................................................................................... 15 3.1.2. Klinisches Auftreten von Aneurysmen .............................................. 19 3.1.3. 3.1.3.Therapiemöglichkeiten ............................................................ 22 3.1.3.1. Operativer Verschluss ...................................................................... 22 3.1.3.2. Endovaskuläre Therapie ................................................................... 23 3.2. Praktischer Teil ................................................................................. 29 3.2.1. In vitro ............................................................................................... 29 3.2.1.1. Zellviabilität ....................................................................................... 29 3.2.1.2. Nekrotische Membranschädigungen ................................................ 30 3.2.2. In vivo/ex vivo ................................................................................... 32 3.2.2.1. Grundprinzip der Röntgenstrahlung ................................................. 32 3.2.2.2. Angiographie .................................................................................... 33 3.2.2.3. Mikro-CT ........................................................................................... 33 3.2.2.4. Magnetresonanztomographie ........................................................... 34 4. Material und Methoden ..................................................................... 36 4.1. In vitro ............................................................................................... 36 4.1.1. Zelllinien ........................................................................................... 36 4.1.2. WST-Assay ....................................................................................... 37 4.1.3. LDH-Assay ....................................................................................... 27 4.2. In vivo ............................................................................................... 38 4.2.1. Aktuelle Studie .................................................................................. 39 4.2.2. Aneurysmainduktion ......................................................................... 39 4.2.3. Antikoagulation ................................................................................. 43 4.2.4. Endovaskulärer Verschluss der Aneurysmen ................................... 43 4.2.5. Kontrollangiographien ....................................................................... 46 4.2.6. Abschlusskontrollen .......................................................................... 46 4.2.7. Euthanasie und Entnahme der Präparate ........................................ 47 4.3. Ex vivo .............................................................................................. 48 4.3.1. Magnetresonanztomographie ........................................................... 48 4.3.2. Mikro-CT ........................................................................................... 52 4.3.3. Histologie .......................................................................................... 52 4.3.4. Statistische Auswertung ................................................................... 53 5. Ergebnisse ........................................................................................ 54 5.1. In vitro ............................................................................................... 54 5.1.1. Zellviabilität ....................................................................................... 54 5.1.2. Untersuchung auf nekrotische Membranschädigungen .................... 54 5.2. In vivo ............................................................................................... 55 5.2.1. Aneurysmainduktion ......................................................................... 55 Inhaltsverzeichnis 5.2.2. Flow Diverter Eigenschaften ............................................................. 56 5.2.3. Angiographische Ergebnisse ............................................................ 57 5.2.3.1. Durchschnittlicher Restfluss ins Aneurysma über den Versuchszeitraum............................................................................... 57 5.2.3.2. Okklusionsrate der Aneurysmen ...................................................... 58 5.2.3.3. Stentverschlüsse .............................................................................. 60 5.3. Ex vivo .............................................................................................. 64 5.3.1. Magnetresonanztomographie ........................................................... 64 5.3.2. Mikro-CT ........................................................................................... 65 5.3.3. Histologie .......................................................................................... 66 5.3.3.1. Aneurysmaokklusion ........................................................................ 66 5.3.3.2. Durchgängigkeit abgehender Gefäße .............................................. 67 5.3.3.3. Neubildung der Neointima ................................................................ 67 5.3.3.4. Durchmesserstenosen ...................................................................... 69 5.3.3.5. Deviceverschlüsse ............................................................................ 69 5.3.3.6. Ossäre Metaplasien und entzündliche Prozesse ............................. 70 6. Diskussion ........................................................................................ 71 7. Fazit .................................................................................................. 77 8 . Literatur ............................................................................................ 78 9. Publikationen ..................................................................................... 95 10. Danksagung ..................................................................................... 96 11. Lebenslauf ........................................................................................ 97 3 Abbildungen, Tabellen, Diagramme, Abkürzungen Abbildungen Nummer Inhalt Seite 1 Aneurysmaformen 16 2 Aneurysmaauftreten 17 3 Prozentuale Aneurysmahäufigkeit im Bereich des Circulus 18 arteriosus Willisii 4 Selektives Rupturrisiko für Aneurysmen 19 5 Manifestierung von Aneurysmen bezüglich verschiedener 20 Altersgruppen 6 Clipping 23 7 Coiling 24 8 Stentassistiertes Coiling 26 9 Aktuell auf dem Markt erhältliche Flow Diverter 27 10 Metabolische Umwandlung von WST-1 in Forazan 29 11 Mechanismen des Zelltodes 30 12 Wirkmechanismus des LDH-Assays 32 13 Freipräparierte Arteria carotis communis (rechts) 40 14 Freipräparierte rechte Arteria carotis communis mit eingeführter 40 4 French Gefäßschleuse 15 Dilatierter Ballon in der A.carotis communis 41 16 Skizze der supraaortalen Gefäße, Lage der Schleuße, des 42 Ballonkatheters und der Elastase während der Aneurysmainduktion 17 Skizze der supraaortalen Gefäße und des Aneurysmas nach 43 der Aneurysmainduktion 18 Angiographische Aufnahme eines induzierten Aneurysmas 44 19 Angiographische Aufnahmen direkt nach der Implantation des 45 Flow Diverters 20 Kontrollangiographien 47 21 Explantierter Flow Diverter 48 22 MRT-Aufnahmen eines Präparates mit verschiedenen 50 Flipwinkeln 23 MRT-Aufnahmen eines Präparates mit unterschiedlichen 51 Inversionszeiten 24 Schnittstellen der Flow Diverter die über die Aneurysmen gelegt 52 wurden 25 Schnittstellen der Flow Diverter die in die Bauchaorta gelegt 53 wurden 26 Einfluss des Flow Diverter Materials auf die Zellviabilität 54 27 Einfluss des Flow Diverter Materials auf Zellnekrose 55 28 Sichtbarkeit der Devices bei Durchleuchtung 57 29 Prozentuale Verteilung der Okklusionsrate der Aneurysmen drei 59 Monate nach der Implantation 30 Prozentuale Verteilung der Okklusionsrate der Aneurysmen 60 sechs Monate nach der Implantation 31 Prozentuale Verschlussrate aller implantierten Flow Diverter 61 32 Durchleuchtungsaufnahme von zwei in die Bauchaorta 62 implantierten Flow Divertern 4 Abbildungen, Tabellen, Diagramme, Abkürzungen 33 3D-Rekonstruktion von zwei in die Baucharterie implantierten 62 Flow Divertern 34 Durchleuchtungsaufnahme von zwei über den Aneurysmen 63 implantierten Flow Divertern 35 Durchleuchtungsaufnahme von Aneurysmen, die mit einem 63 Flow Diverter überstentet wurden 36 MRT Aufnahme eines in die Baucharterie implantierten Flow 64 Diverters 37 MRT Aufnahme eines verschlossenen Flow Diverters 64 38 Mikro-CT-Aufnahmen von Flow Divertern die in der 65 Baucharterie abgesetzt wurden 39 Mikro-CT-Aufnahmen von Flow Divertern die über dem 65 Aneurysma abgesetzt wurden 40 Mikro-CT-Aufnahmen von Flow Divertern die über dem 66 Aneurysma abgesetzt wurden und die bei der Nachkontrolle verschlossen waren 41 Querschnitt durch Aneurysmen, nach histologischer 66 Aufbereitung 42 Querschnitt durch Flow Diverter und überstentete Gefäße 67 43 Neointiale Proliferation entlang der Stentstreben 67 44 Neointima im Gefäßlumen 68 45 Querschnitt durch verschlossene Flow Diverter 69 Tabellen Nummer Inhalt Seite 1 Genetische und erworbene Risikofaktoren 17 2 Flow Diverter Größen des Derivo® 36 3 Verteilung der Größenverhältnisse der Aneurysmen 56 4 Durchschnittliche Aneurysmagröße 56 5 Klassifikation der Okklusionsrate 58 6 Übersicht der Okklusionsraten 60 7 Neointimadicke im Flow Diverterlumen 68 8 Durchmesserstenose in den implantierten Flow Divertern 69 Diagramme Nummer Inhalt Seite 1 Stärke des Signal-to-Noise-Ratio bei Messung mit 49 verschiedenen Flipwinkeln 2 Intensität des Contrast-to-Noise Signals bei unterschiedlichen 51 Inversionszeiten 3 Durchschnittlicher Restfluss ins Aneurysma über den 58 Versuchszeitraum Materialien Geräte Angioanlage [Ziehm Vision] Brutschrank BBD6220 [Heraeus] ELISA-Reader Infinite F200 [TECAN] Falcon Tubes 15ml, 50ml BD Falcon TMTubes [BD Bioscience Bedford 5 Abbildungen, Tabellen, Diagramme, Abkürzungen MA, USA] Kleintier-MRT PharmaScan 9,4Tesla [Brucker, USA] Mikro-CT Skyscan 1172 [Brucker, USA] Mikroskop Eclipse 80i [Nikon, Düsseldorf, Deutschland] Multipipette 1200 µl, 100 µl [Eppendorf] Perfusor Perfusor [B.Braun, Melsungen, Deutschland] Pinzetten [FST Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland] Pipetten 0,5-10 µl, 2-20 µl, 10-100 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl [Brand] Rasierapparat Aesculap Favorita [B.Braun AG Melsungen, Deutschland] Scheren [FST Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland] Skalpell [FST Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland] Spektralphotometer SLT RainBow [SLT Laboratories GmbH] Spektralphotometer Spectr Fluor [TECAN] Sterilbank Steril GARD A/B3 [The Baker Company] Tischzentrifuge Biofuge pico [Heraeus] Statistikprogramm IBM SPSS Statistics [SPSS Inc. Chicago] Verbrauchsmaterialien Aspirationspipette [Greiner Bio-One GmbH, Bestell Nr.710183] Bepanthen Augensalbe [Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Deutschland] Culture slides [Greiner Bio-One GmbH, Bestell Nr.96170202] Dauerverweilkanüle Optiva 2,22G, Durchmesser 0,9mm [ ] Deckgläser [Marienfeld GmbH&Co KG, Bad Mergentheim, Deutschland] Flächendesinfektion Bacillol AF [Varitec] Fogartyballon [Baxter Healthcare, Irvine, Calif] Gefäßschleuse [Cordis Endovascular Miami lakes, Flolida,USA] Handschuhe Vasco Nitril White [B.Braun Melsungen AG, Deutschland] Kanülen BD MicrolanceTM3 Becton [Dickison and Company Limited, Drogheda Co Louth, Ireland] Kontrastmittel Ultravist [Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Deutschland] Mehr-Wege-Hahn Discofix C 3SC [B.Braun Melsungen Ag, Deutschland] Mersilenefaden Ethicon Vicryl V908E 5PH.Eur. [Johnson&Johnson intl. c/o European Logistics Centre, Belgium] Mikrokatheter Tracker Exel 14 2-Tip [Boston Scientific, Fremont, Ca/USA] Mikrotiterplatten 96 Well, F-bottom, transparent [Greiner Bio-One GmbH] Mullkompressen [Fink&Walter GmbH, Merchweiler, Deutschland] Objektträger [Menzel-Gläser, Braunschweig, Deutschland] PP-Reaktionsgefäß (Eppi) 1 ml; 1,5 ml; 2 ml [Greiner Bio-One GmbH] Pipettenspitzen 0,5-10 µl, 2-20 µl, 10-100 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl [Eppendorf] Pipetten 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml [Greiner Bio-One GmbH] PP-Probenröhrchen 15 ml, 50 ml [Greiner Bio-One GmbH] Schleuse Avanti+Introducer [Cordis Endovascular, Miami lakes, 6 Abbildungen, Tabellen, Diagramme, Abkürzungen Florida, USA] Spritzen 3ml, 5ml; Syringe Luer-LokTM Tip [BD, Franklin Lakes, NJ, USA] Spritzen 10ml, Omnifix Luer-Lock Solo [B.Braun Melsungen AG, Deutschland] Y-Connector The BigEasy Rotation Y-Connector 90F/3mm [ev3, Plymouth, Minnesota, USA] Reagenzien Cell Proliferation Reagent [Roche Diagnostics, Bestell Nr. 11644807001] WST-1 Cytotoxicity Detection Kit [Roche Diagnostics, Bestell Nr. 11644793001] (LDH) Elastase Schweine-Elastase [Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland] Eosin [Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland] Ethanol [JT Backer, Deventer, Niederlande] Formaldehyd [Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland] Hämatoxylin n. Mayer [Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland] Hautdesinfektionsmittel Softasept N [B.Braun Melsungen AG, Deutschland] Heparin-Natrium 25000I.E./5ml [B.Braun Melsungen AG, Deutschland] Methanol [JT Backer, Deventer, Niederlande] Methylmethacrylat Technovit 9100 [Heraeus, Hanau, Deutschland] NaCl (isotone B.Braun Infusionslösung [Braun Melsungen AG, Kochsalzlösung 0,9%) Deutschland] Paraffin [Merk KGaA, Darmstadt, Deutschland] PBS-Lösung [PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich] TritonX-100 [SERVA, Bestell Nr. 37240] Ultravist-370 [Bayer Vital, Leverkusen, Deutschland] Xylol [JT Backer, Deventer, Niederlande] Zellkulturmedium RPMI 1640 [Invitrogen, Bestell Nr. 21875-034] Medikamente Carprofen Rimadyl cattle 50mg/ml [Pfizer, Berlin, Deutschland] Ketamin Ursotamin 100mg/ml [Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Deutschland] Xylazin Rompun 2% [Bayer vital GmbH] Pentobarbital Narcoren [Merial GmbH, Halbergmoos,DE] Plavix (Clopidrogel) 75mg [Sanofi-Aventis, Deutschland] ASS +C Brausetabletten [Ratiopharm GmbH, Deutschland] Abkürzungen A. abdominalis Arteria abdominalis A. dissecans Aneurysma dissecans A. spurium Aneurysma spurium A. subclavia Arteria subclavia Abb. Abbildung AV-Fistel Ateriovenöse Fistel 7 Abbildungen, Tabellen, Diagramme, Abkürzungen ca. circa °C Grad Celsius cm Zentimeter CT Computertomographie D (2D, 3D) dimensional d Tage DSA Digitale Subtraktionsangiographie eER Endoplasmatisches Retikulum F French g Erdbeschleunigung/Gravitation GDC Guglielmi-Detachable-Coils h Stunden HE Hämatoxylin-Eosin IE Internationale Einheit i.m. intra muskulär INT Iodotetrazoliumchloride i.v. intra venös kg Kilogramm kV Kilovolt LDH Lactatdehydrogenase mg Milligramm min Minuten ml Milliliter mm Millimeter MRT Magnetresonanztomograph ms Millisekunden MTP-Reader Mikrotiterplatter-Reader n Anzahl NaCl Natriumchlorid NAD+ Nicotinamidadenindinukleotid (oxidierte Form) NADH Nicotinamidadenindinukleotid (reduzierte Form) nm Nanometer NSAID Non steroidal antiinflammatory drugs PBS Phosphate buffered saline SAB Subarachnoidalblutung SNR Signal-to-Noise-Ratio TE Echozeit TOF Time of flight TR Pulswiederholzeit U Unit WST Water soluble tetrazolium z.B. Zum Beispiel 8 Historischer Hintergrund und Zielsetzung der Arbeit 1.Historischer Hintergrund und Zielsetzung der Arbeit Die ersten schriftlichen Berichte über Aneurysmen gehen bis ins Alte Ägypten zurück (30), präzise anatomische Schilderungen sind aber erst im 16. und 17. Jahrhundert zu finden (51, 54). 1804 wurden Aneurysmen zum ersten Mal anatomisch unterteilt. Erste Behandlungsversuche durch Exstripation beschrieb ein Arzt namens Antyllos im 3. Jahrhundert (121). Erst im 18. Jahrhundert begannen erste Ligarturversuche von Aneurysmen. Studien belegen, dass etwa 2% der Bevölkerung Träger eines Aneurysmas sind (124). In Autopsiestudien konnte sogar belegt werden, dass bis zu 7,8% der gesamten Bevölkerung und 11,6% der 40-49jährigen Aneurysmen haben (92). Hauptsächlich wird eine spontane Subarachnoidalblutung (SAB) durch die Ruptur eines Aneurysmas der basalen Hirngefäße verursacht, wodurch arterielles Blut in den Subarachnoidalraum eintritt. Dreißig Prozent der Patienten bei denen eine Ruptur des Aneurysmas stattgefunden hat, versterben bereits vor Erreichen des Krankenhauses. Von den Patienten, die das Krankenhaus noch rechtzeitig erreichen, versterben dreißig Prozent noch im Krankenhaus und ein weiteres Drittel trägt eine dauerhafte Behinderung davon. Heute stehen zur Behandlung von Aneurysmen verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung. Zum einen besteht die Möglichkeit das Aneurysma chirurgisch mit Hilfe eines Gefäßclips zu verschließen. Dies ist aber oftmals wegen einer vorhandenen Hirnschwellung sowie des Blutes im Subarachnoidalraum schwierig, hinzu kommt, dass manche Aneurysmen auch anatomisch ungünstig liegen. Eine weitere Möglichkeit zur Behandlung von Aneurysmen stellen die, in den 70er Jahren entwickelten, endovaskulären Therapien dar. Zu Beginn arbeitete man mit ablösbaren Latexballons, die an Mikrokathetern befestigt waren. Im Laufe der Jahre wurden Design und Materialverbesserungen entwickelt, um die Trägergefäße besser zu schützen. Ein wirklicher Durchbruch aber gelang erst Anfang der 90er Jahre durch Guglielmi (47) mit der Entwicklung von elektrolytisch ablösbaren Platinspiralen (GDC). Mit Hilfe dieser endovaskulären Therapie zur Behandlung intrakranieller Aneurysmen besteht unmittelbar nach der diagnostischen Angiographie die Möglichkeit, einen speziell markierten Mikrokatheter koaxial durch einen Führungskatheter in nahezu jedes intrakranielle Aneurysma zu leiten. Mittlerweile stellt die endovaskuläre Behandlung von intrakraniellen Aneurysmen zwar einen minimal invasiven Eingriff dar, jedoch ist dieser nicht frei von Risiken. Zu 9 Historischer Hintergrund und Zielsetzung der Arbeit diesen gehören vor allem thromboembolische Komplikationen mit distalen Gefäßverschlüssen oder zerebralen Infarkten. Die Ursachen sind zum Teil materialbedingt oder haben eine mechanische Ursache wie das Herausschwemmen von Thromben aus dem Aneurysma. Ebenfalls stellt sich die Rekanalisation von initial nicht vollständig verschlossenen Aneurysmen oftmals als problematisch dar. Seit einigen Jahren bietet die aktive Beeinflussung des Blutstroms durch sogenannte Flow Diverter eine gute alternative Behandlungsmöglichkeit zu bisher verwendeten Coils, Stents oder Stent-Coil–Kombinationen. Ein Flow Diverter besteht aus einem dichten Netzwerk aus dünnen Drähten, die die Strömungsverhältnisse ins Aneurysma so beeinflussen, dass es nach kurzer Zeit zur Stase des Blutes und anschließender Thrombogenisierung im Aneurysma kommt, die dünnen Drahtmaschen verhindern dabei ein Abfließen des Gerinnsels aus dem Aneurysma. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel dieser Studie die aktuellen Entwicklungen eines Flow Diverters aufzuzeigen und gleichzeitig unter Betrachtung verschiedener Parameter die Stärken und Schwächen dieses Flow Diverters (Derivo) im Vergleich zu vorangegangenen Modellen zur endovaskulären Behandlung von Aneurysmen aufzuzeigen . Hierbei sind folgende Fragen zu beantworten: • Hat das Material des Flow Diverters cytotoxische Auswirkungen auf ihn umgebende Zellen • Welche Risiken birgt die endovaskuläre Aneurysmatherapie mit Flow Divertern? • Welche Komplikationen sind während oder nach dem Eingriff aufgetreten? • Wie oft treten Komplikationen auf? • Wie häufig ist es möglich das Aneurysma direkt bei der Behandlung komplett zu verschließen? • Wie viel Zeit wird benötigt bis zum kompletten Verschluss des Aneurysmas? • In wie vielen Fällen ist es überhaupt möglich das Aneurysma zu verschließen? • Wie oft treten thromboembolische Komplikationen auf? • Wie beeinflusst der Stent die Gefäßwand? • Kommt es zur Ausbildung einer „neuen“ Neointima im Lumen des Flow Diverters? 10