Untersuchungen zur Leistungsfähigkeit von Zelllinien mit Kassettenaustauschsystem Von der Fakultät für Lebenswissenschaften der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr.rer.nat.) genehmigte D i s s e r t a t i o n von Elisabeth Bludau aus Riesa 1. Referent: apl. Professor Dr. Udo Rau 2. Referent: Professor Dr. Stefan Dübel eingereicht am: 28.11.2014 mündliche Prüfung (Disputation) am: 18.03.2015 Druckjahr 2015 Vorveröffentlichungen der Dissertation Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Fakultät für Lebenswissen- schaften, vertreten durch den Mentor der Arbeit, in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht: Tagungsbeiträge Bludau, E.; Veith, N.; Baydoun, L.; Geiszkopf, A.; Paulsen, J.; Duvar S.; Hecht, V.; Ziehr, H.: Development of a Standardized Platform for Production of Antibodies on Basis of CHO Cells. (Poster) 5th Conference on Protein and Antibody Engineering Summit (PEGS) Vienna, Austria (2012) Bludau, E.; Veith, N.; Beuerle, B.; Schwager, C.; Hecht, V.; Ziehr, H.: Shortened timeline for cell line development – adaptation of recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) to suspension CHO cells. (Poster) 13thmeeting of the European Society for Animal Cell Technology (ESACT) Lille, France (2013) Bludau, E.; Veith, N.; Beuerle, B.; Schwager, C.; Hecht, V.; Ziehr, H.: Shortened timeline for cell line development – adaptation of recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) to suspension CHO cells. (Poster) 11th Conference on Protein Expression in Animal Cells (PEACE) Kananaskis, Canada (2013) Bludau, E.; Hecht, V.; Ziehr, H.: RMCE-based Cell Line Development – Towards Predictable and Reproducible Transgen Expression?. (Poster) 14th Conference on Cell Culture Engineering (CCE) Quebec, Canada (2014) Inhaltsverzeichnis | V Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung .............................................................................................................. 8 Abstract................................................................................................................................ 9 1. Einleitung .....................................................................................................................10 1.1 Konventionelle Generation von Produktionszelllinien ......................................11 1.2 Ortsspezifische Rekombinationssysteme in der Zelllinienentwicklung ..........14 1.2.1 Rekombinase-vermitteltes Kassettenaustauschsystem ....................................15 1.3 Zellkulturprozesse für die Produktion rekombinanter Proteine .......................17 1.4 Statistische Versuchsplanung ............................................................................19 2. Zielsetzung ...................................................................................................................23 3. Ergebnisse und Diskussion ........................................................................................24 3.1 Identifizierung stabiler chromosomaler Loci für die Generation von CHO- Masterzelllinien ....................................................................................................24 3.1.1 Virusproduktion zur Markierung chromosomaler Loci .......................................24 3.1.2 Lentivirale Transduktion von CHO-S Zellen .....................................................25 3.1.3 Austauschbarkeit markierter chromosomaler Loci ............................................26 3.1.4 Langzeitstabilität markierter Masterzelllinien ....................................................29 3.2 Expression rekombinanter Proteine an definierten chromosomalen Loci ......30 3.2.1 Ortsspezifische Rekombination führt zu vorhersagbarer Antikörperexpression 32 3.2.2 Homogene Proteinexpression der Targetingpoole und -subklone ....................38 3.2.3 Langzeitstabilität von mit Kassettenaustausch generierten Zellklonen .............41 3.3 Etablierung von Hochproduzentenzelllinien unter Verwendung des GS Expressions-Systems .........................................................................................42 3.3.1 Isolierung und Genamplifikation Antikörper-exprimierender GS-Klone .............42 3.3.2 Langzeitstabilität der generierten GS-Klone .....................................................48 3.3.3 Die wiederholte Nukleofektion einer GS-Zelllinie generiert Hochproduzentenzelllinien ...............................................................................52 3.3.4 Leistungsfähigkeit des GS6 Klon 132 in Fed-Batch Kultivierungen ..................54 3.4 Charakterisierung Antikörper-produzierender CHO Zelllinien in Fed-Batch Versuchen ............................................................................................................58 Inhaltsverzeichnis | VI 3.4.1 Identifizierung signifikanter Einflussgrößen unter Verwendung statistischer Versuchsplanung .............................................................................................59 3.4.1.1 Vergleich der Fed-Batch Kultivierungen verschiedener GS-Klone ............59 3.4.1.2 Vergleich der Fed-Batch Kultivierungen verschiedener RMCE-Klone .......69 3.5 Ausblick ...............................................................................................................78 4. Material und Methoden ................................................................................................80 4.1 Material .................................................................................................................80 4.1.1 Antibiotika ........................................................................................................80 4.1.2 Antikörper ........................................................................................................80 4.1.3 Bakterienstämme .............................................................................................80 4.1.4 Chemikalien und Reagenzien ..........................................................................81 4.1.5 Enzyme und Reaktionspuffer ...........................................................................82 4.1.6 Geräte ..............................................................................................................83 4.1.7 Medien und Zusätze ........................................................................................84 4.1.8 Oligonukleotide ................................................................................................84 4.1.9 Reaktionskits ...................................................................................................85 4.1.10 Software ..........................................................................................................85 4.1.11 Vektoren ..........................................................................................................85 4.1.12 Zelllinien ..........................................................................................................86 4.2 Methoden .............................................................................................................87 4.2.1 Molekularbiologische Methoden .......................................................................87 4.2.1.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien ...........................................87 4.2.1.2 Agarose-Gelelektrophorese ......................................................................87 4.2.1.3 DNA-Spaltung mittels Restriktionsenzymen..............................................88 4.2.1.4 Glätten überhängender Enden an DNA-Fragmenten ................................89 4.2.1.5 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten ..............................................90 4.2.1.6 Isolierung von DNA aus Agarosegelen .....................................................90 4.2.1.7 Ligation von DNA-Fragmenten .................................................................90 4.2.1.8 Transformation .........................................................................................91 4.2.1.9 Plasmidpräparation ...................................................................................91 Inhaltsverzeichnis | VII 4.2.1.10 Isolierung genomischer DNA ....................................................................92 4.2.1.11 DNA-Konzentrationsbestimmung ..............................................................92 4.2.1.12 Sequenzierung von DNA ..........................................................................92 4.2.1.13 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ............................................................93 4.2.2 Zellkulturmethoden ..........................................................................................94 4.2.2.1 Revitalisierung kryokonservierter Zellen ...................................................94 4.2.2.2 Kultivierung von CHO Suspensionszellen .................................................94 4.2.2.3 Kultivierung adhärenter HEK293T Zellen ..................................................95 4.2.2.4 Zellzahlbestimmung ..................................................................................95 4.2.2.5 Kryokonservierung von Zellen ..................................................................96 4.2.2.6 Durchflusszytometrie ................................................................................96 4.2.2.7 Zellsortierung (FACS) ...............................................................................96 4.2.2.8 Einzelzellklonierung mittels semi-solidem Medium ...................................96 4.2.2.9 Gentransfermethoden ...............................................................................97 4.2.2.10 Single Cell Secretion Assay ......................................................................99 4.2.2.11 Bestimmung der spezifischen Produktivität von Suspensionszellen ....... 100 4.2.2.12 Titerbestimmung ..................................................................................... 100 4.2.2.13 Batch und Fed-Batch Kultivierung von CHO-Zellen im Schüttelkolben ... 101 4.2.3 Analytische Methoden .................................................................................... 101 4.2.3.1 Konzentrationsbestimmung von D-Glukose und L-Laktat ....................... 101 4.2.3.2 Messung von pH, pO , pCO .................................................................. 102 2 2 4.2.3.3 Quantifizierung der Proteinexpression mittels ELISA .............................. 102 4.2.3.4 Quantifizierung der Antikörperexpression mittels ProA HPLC ................. 103 Literaturverzeichnis ......................................................................................................... 105 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................... 116 Abbildungsverzeichnis .................................................................................................... 119 Tabellenverzeichnis ......................................................................................................... 121 Zusammenfassung | 8 Zusammenfassung Die kommerzielle Entwicklung von Produzentenzelllinien basiert meist auf der zufälligen Integration vieler Transgenkopien in das Wirtsgenom und der anschließenden aufwändigen Selektion zur Identifizierung stabiler Hochproduzenten. Das Rekombinase-vermittelte Kassettenaustauschsystem (RMCE) ist bereits in früheren Arbeiten als aussichtsreiche Alternative für die vorhersagbare Entwicklung von Zelllinien beschrieben worden (Rose et al. 2013; Rehberger et al. 2013; Turan et al. 2013; Noh et al. 2013). Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung inwieweit RMCE-basierte Zelllinien im Vergleich zu konventionell entwickelten auch in Kultivierungsprozessen vorhersagbare und homogene Wachstums- und Produktionseigenschaften aufweisen. Aus diesem Grund war zunächst die parallele Entwicklung des RMCE-Systems sowie einer Modellzelllinie erforderlich. Die RMCE- kompatiblen Masterzelllinien wurden basierend auf CHO-Suspensionszellen mit eGFP- transduzierenden Lentiviren markiert. Nach der Identifikation austauschbarer und transkriptionell aktiver chromosomaler Loci wurden RMCE-Versuche mit drei vollständigen Antikörpern, einem Antikörper-Fragment und tPA durchgeführt. Die Selektion von RMCE- Subklonen erfolgte mittels zweifacher FACS-Anreicherung ohne Einsatz selektiver Agentien. Die Subklone wiesen eine homogene Expression auf, welche mit dem jeweiligen Targetingpool korrespondierte. Die Ergebnisse deuten jedoch nicht auf die universelle Einsetzbarkeit eines definierten Locus für die Expression verschiedener Proteine hin. Da für die vollständigen Antikörper sehr vergleichbare Expressionsstärken erzielt wurden, scheint es vielmehr, dass bestimmte Loci für die Expression bestimmter Proteine geeignet sind. Die GS-basierten Modellzelllinien, welche mittels zweifacher Nukleoporation generiert wurden, erzielten finale Titer von 3,5 g L-1 in Fed-Batch Versuchen. Die untersuchten Klone waren in Abwesenheit von MSX jedoch nicht langzeitstabil. Ferner konnte kein positiver Zusammenhang zwischen der MSX-Konzentration und der spezifischen Produktivität der GS-Klone erkannt werden. Bei den im Versuchsraum untersuchten Einflussfaktoren während der Fed-Batch Kultivierung zeigte sich, dass die drei von einem Transfektionspool stammenden GS6 Klone unterschiedlich signifikant beeinflusst werden. Dies korreliert mit den während der Klonselektion beobachteten heterogenen Produktivitäten der GS-Klone. Die drei RMCE-Klone, welche aus zwei unterschiedlichen Targetingpoolen hervorgegangen sind und zwei verschiedene vollständige Antikörper exprimierten, zeigten in Fed-Batch Kultivierungen innerhalb des Versuchsraumes vergleichbare Wachstums- und Produktionseigenschaften. Damit zeigte sich erstmalig, dass RMCE-basierte Zelllinien im Vergleich zu konventionell entwickelten vorhersagbare und homogene Wachstums- und Produktionseigenschaften in einem Kultivierungsprozess aufweisen. Abstract | 9 Abstract Conventional cell line development is mostly based on random multicopy transgene integration followed by a time and labor consuming screening procedure to identify stable high-producer. Previous publications characterized the recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) as a promising alternative for the development of cell lines in a predictable manner (Rose et al. 2013; Rehberger et al. 2013; Turan et al. 2013; Noh et al. 2013). Aim of this thesis was to investigate whether RMCE-based cell lines reveal comparable and predictable growth and production characteristics in culture processes as well in comparison to conventional cell lines. For this reason the parallel development of the RMCE-system as well as a GS-based model cell lines was required. RMCE master cell lines based on CHO suspension cells were tagged with eGFP transducing lentiviruses. After having identified exchangeable and transcriptionally active chromosomal loci, RMCE experiments with three fullsize antibodies, one antibody fragment and tPA have been performed. The selection of positive RMCE-events was conducted via FACS without any selective agents (antibiotics). The transgene expression among the subclones was homogenous and moreover corresponding to the respective targetingpool. However, the results do not indicate the universal applicability of a certain chromosomal locus for recombinant protein expression. The results rather support the theory that some loci are appropriate for the expression of certain proteins, since the expression level among the full size antibodies was quite similar. The GS-based model cell lines were established after dual nucleofection and subsequent selection by means of a single cell secretion assay. In fed-batch processes the GS-model cell lines reached peak titers of 3.5 g L-1. However, in absence of MSX the clones were not stable. Moreover no positive correlation was observed between MSX-concentration (for gene amplification) and specific productivity of the respective GS-clones. Investigation of GS-clones within a defined design-space in fed-batch processes revealed different significantly influencing parameters among the clones deriving from a common pool. This result correlated with the heterogeneous productivities among the GS-clones during the clonal screening procedure. Three antibody producing RMCE-derived clones have been investigated exemplarily as well in fed-batch processes within a defined design space. All of them demonstrated comparable growth and production characteristics. The results have shown, for the first time, that RMCE-based cell lines reveal homogeneous growth and production characteristics in a culture process in comparison to conventionally generated cell lines. Einleitung | 10 1. Einleitung Im Jahr 2013 wurden sieben der zehn meistverkauften biologischen Medikamente in CHO (Chinese Hamster Ovary) Zellen produziert. Dies resultierte in einem weltweiten Absatz von fast 42 Mrd. US Dollar. Sechs der zehn meistverkauften Medikamente waren ferner monoklonale Antikörper (Noh et al. 2013; Huggett 2013). Seit der Zulassung des gewebespezifischen Plasminogenaktivators 1987 als erstes in Säugerzellen produziertes rekombinantes therapeutisches Protein, stellt die CHO Zelllinie ein bevorzugt verwendetes Expressionssystem dar. Weitere industriell genutzte Säugerzelllinien sind BHK (Baby Hamster Kidney), HEK (Human Embryonic Kidney) sowie SP2/0. Obgleich bakterielle Expressiossysteme, wie Escherichia coli, im Vergleich zu Säugerzellen ein deutlich robusteres und schnelleres Wachstum bei geringeren Produktionskosten und besseren Ausbeuten aufweisen, ist ihr Unvermögen, posttranslationale Proteinmodifikationen, durchzuführen ein entscheidender Nachteil (Agrawal & Bal 2012; Butler 2005). Rekombinante Proteine, produziert in CHO-Zellen, weisen hingegen eine vergleichbare Qualität wie humane Proteine sowie posttranslationale Modifikationen wie die Glykosylierung auf. Obwohl es eine Vielzahl von alternativen Säugerzellen für die rekombinante Proteinproduktion gibt, werden 70 % der rekombinanten Therapeutika in CHO Zellen generiert (Jayapal 2007). Ferner konnten die Produktionsprozesse in den vergangenen 25 Jahren im Hinblick auf die Produkttiter, die maximalen Zellkonzentrationen und zellspezifische Produktivität deutlich verbessert werden. Dies wurde vornehmlich durch die Optimierung der Kultivierungsmedien, der Kultivierungsprozesse sowie auch die Entwicklung von Produktionszelllinien realisiert (Noh et al. 2013). Die Etablierung einer stabilen Produktionszelllinie mit hohen zellspezifischen Produktivitäten ist dabei ein sehr langwieriger und arbeitsintensiver Prozess, welcher einen entscheidenden Engpass bis zur Vermarktung des therapeutischen Produkts darstellen kann (Agrawal & Bal 2012). Die kommerzielle Zelllinienentwicklung erfolgt meist auf konventionellem Weg unter Verwendung des DHFR (Dihydrofolatreduktase)- oder GS (Glutaminsynthetase)-Systems. Beide Systeme beruhen auf der zufälligen Integration vieler Transgenkopien in das chromosomale Wirtsgenom und der anschließenden Gen-Amplifikation durch ein selektives Reagenz. Dieser Ansatz bedingt jedoch, dass weder die Anzahl noch die Integrationsstelle der Expressionskassette und somit auch nicht die Expressionsstärke des Transgens vorhergesagt werden können. Aus diesem Grund muss eine Vielzahl (n>1000) von Einzelzellklonen hinsichtlich ihrer Expressionsstärke sowie ihrer Stabilität untersucht werden (L. Barnes et al. 2003).