BotáNica-morfoloGía http://www.icn.unal.edu.co/ Caldasia 33(2):3B4o9n-3za6n6i. e2t0 a1l1. ESTUDIOS MORFO-ANATÓMICOS DE GINECEO Y FRUTO EN ESPECIES DE MENTHA (LAMIACEAE) DE ARGENTINA Morpho-anatomical study of gynoecium and fruit in Mentha (Lamiaceae) species from Argentina Norma E. BoNzaNi Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal y Facultad de Ciencias Químicas (UNC). CC..CC.. 495. 5000. Córdoba, Argentina. [email protected] ViViaNa S. BraVi Departamento de Farmacia. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Nacional de Córdoba (UNC), Córdoba, Argentina. [email protected] Gloria E. BarBoza Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal y Facultad de Ciencias Químicas (UNC). C.C. 495. 5000. Córdoba, Argentina. [email protected] RESUMEN Se realizaron estudios morfológicos y anatómicos de gineceo y fruto, utilizando microscopía óptica y electrónica de barrido, en especies de Mentha (sect. Mentha L.y sect. Pulegium (Mill.) Coss. & Germ.). Se registran por primera vez para el género algunas novedades sobre el gineceo, histología del nectario, microesculturas en el epicarpo, presencia de ceras epicuticulares en el hilo y la morfología de los cristaloides. Se establecieron cuatro tipos de microesculturas en núculas maduras. Los resultados son evaluados desde el punto de vista taxonómico para la delimitación de las especies. Además, se registra por primera vez mixocarpia en M. citrata, M. x piperita y M. spicata y se plantean algunas consideraciones sobre este fenómeno. Palabras clave. Nectario, núculas, mixocarpia, ceras epicuticulares, Mentheae. ABSTRACT Morphological and anatomical studies on the gynoecium and fruit of Mentha species (sect. Mentha L. and sect. Pulegium (Mill.) Coss. & Germ.) from Argentina were done using optic and scanning electronic microscope. Some novelties on the gynoecium, nectary histology, microsculpture of the nutlets, epicuticular waxes in the hilum and the morphology of the crystalloids are reported for the first time for Mentha. Four types of microsculpture on the surface of the nutlets were established. The results are evaluated from a taxonomical point of view for species delimitation. In addition, myxocarpy is reported for M. citrata, M. x piperita and M. spicata for the first time and its occurrence is discussed. Key words. Nectary, nutlets, myxocarpy, epicuticular waxes, Mentheae. 349 Morfoanatomía de gineceo y fruto en Mentha INTRODUCCIÓN Desde el punto de vista exomorfológico, la presencia de ceras epicuticulares depositadas El género Mentha L. (fam. Lamiaceae, subfam. en el hilo sólo son mencionadas para otros Nepetoideae, tribu Mentheae), originario de taxones de Lamiaceae (Martín-Mosquero Europa y Asia, se halla naturalizado en et al. 2004), mientras que el estudio de las América encontrándose en Argentina tres microesculturas de la superficie de las núculas especies y dos híbridos (Bonzani et al. 2007). ha recibido más atención por su relevancia Estas especies pertenecientes a las sect. taxonómica (Salmaki et al. 2008, Marin et Mentha (Mentha citrata Ehrh., M. spicata al. 1994, Martín-Mosquero et al. 2006a,b, L., M. x piperita L. y M. x rotundifolia (L.) Moon & Hong 2006). Por último, Bouman Hudson y a la sect. Pulegium: M. pulegium & Meeuse (1992) destacan la importancia de L., son muy apreciadas por sus propiedades estos caracteres como estrategia de dispersión terapéuticas y por su alto contenido en aceites y hacen referencia, entre otros taxones, a esenciales, se utilizan en preparaciones Mentha aquatica L. farmacéuticas y como fitoterápicos, además de ser expendidos en el comercio como La mixocarpia, que consiste en la liberación medicamento herbolario. Por sus propiedades de mucílago por las células del epicarpo de aromáticas y saporíferas su uso se extiende las núculas maduras en contacto con el agua, también a la repostería, licorería e industria es otro aspecto interesante de Lamiaceae de las golosinas (Bruneton 1991, Alonso reportada en varios géneros, incluido Mentha 1998, 2004, Lawrence 2006). (Witzthum 1978, Ryding 1992a, 2001, Duletiæ-Lauševiæ & Marin 1999, Fernández- De los estudios taxonómicos del género Alonso et al. 2009). se destacan los trabajos de Harley (1972), Harley & Brighton (1977), Mabberley (1997) A fin de continuar contribuyendo con el y Gober et al. (2002), reconociéndose hasta conocimiento del género, abordamos en esta el momento 25 especies y varios híbridos oportunidad el estudio de las estructuras (Harley & Brighton 1977). Estudios previos reproductivas con los siguientes objetivos: 1) se han referido a la morfo-anatomía de conocer la estructura del gineceo abarcando los órganos aéreos (tallos, hojas) y a las un detallado estudio del nectario, 2) proveer estructuras secretoras de Mentha, fuentes una descripción de la morfo-anatomía de las de obtención de aceites esenciales (Clauss núculas, incluyendo las microesculturas de su & Tyler 1968, Muñoz Centeno et al. 1998, superficie, 3) describir la morfología de las Martins 2002, Martins & Martins 2003, ceras epicuticulares depositadas en el hilo, Bonzani et al. 2007). Por su parte, las 4) comprobar la presencia de mixocarpia en estructuras reproductivas, es decir ovario, núculas maduras, 5) evaluar el significado nectario, fruto y órganos de dispersión taxonómico de las variaciones observadas en (núculas) fueron descritas por Hedge (1970) tales caracteres. y Cronquist (1981) para Lamiaceae en general. MATERIALES Y MÉTODOS Con respecto a la estructura anatómica del Se trabajó con materiales frescos y pericarpo se destacan los trabajos de Moon herborizados, todos provenientes de Argentina & Hong (2006), Duletiae-Lauševiaæ & Marin y depositados en el Herbario del Museo (1999) y Ryding (1992a,b, 1993, 1995, 2008) Botánico de Córdoba (CORD), Argentina. Las quienes, junto a otros géneros de Lamiaceae, especies analizadas fueron: M. citrata Ehrh.: analizan algunas especies de Mentha. Prov. Córdoba, Dpto. Colón, Salsipuedes, 29 350 Bonzani et al. set 1996, Ariza Espinar 3420 y 3421; Prov. se realizó con hipoclorito de sodio al 30 % Córdoba, Dpto. Capital, Bower, 30 mar 2008, y posterior lavado con agua destilada. Para Bonzani 118. seguir el recorrido de los haces vasculares se M. spicata L.: Prov. Córdoba, Dpto. Colón, tiñó con safranina acuosa al 1%. El contenido Salsipuedes, 17 ene 2000, Bonzani 83; de almidón del nectario se evidenció con Prov. Córdoba, Dpto. Capital, Barrio Urca, solución de lugol (iodo-ioduro de potasio). 15 feb 2000, Bonzani 88; Prov. San Juan, Para describir la organización histológica del Dpto. Caucete, 21 dic 1980, Hunziker & nectario se siguió la terminología propuesta Subils 23956. por Nepi (2007). M. pulegium L.: Prov. Córdoba, Dpto. Colón, Saldán, San Remo, 21 ene 2000, Bonzani 86; Se empleó también el microscopio electrónico Prov. Buenos Aires, Partido J. Madariaga, de barrido (MEB) para el análisis del gineceo Ruta 74 entre Gral. Madariaga y Las Armas, y superficie de núculas maduras. Se aplicó 21 ene 1973, Di Fulvio 309. la técnica de Gesterberger & Leins (1978), M. x piperita L.: Prov. Córdoba, Dpto. Colón, secado a punto crítico, montaje sobre discos Saldán, Los Alazanes, 21 ene 2000, Bonzani de aluminio con cinta adhesiva doble faz y 84 y Bonzani 88; Prov. San Juan, Dpto. posterior baño de oro. Chimbas, 6 ene 1961, Ariza Espinar 1298. M. x rotundifolia (L.) Hudson: Prov. Córdoba, Para evidenciar la producción de mucílago Dpto. Colón, Salsipuedes, 24 ene 2000, en las núculas maduras se siguieron dos Bonzani 87; Prov. Córdoba, Dpto. Capital, procedimientos: a) se prepararon cámaras Bower, 2 dic 2002, Bonzani 93; Prov. San húmedas montadas en placas de Petri, con Juan, Dpto. Chimbas, 7 ene 1960, Ariza papel de filtro embebido en agua destilada y Espinar 666. mantenidas con luz a una temperatura de 25- 27° C, siguiendo la técnica de Alburquerque Se realizaron preparados histológicos & Andrade (1998); b) se sumergieron las permanentes; el material fresco (ovario y núculas directamente en agua destilada en núculas) fue fijado en FAA (formol, alcohol tubos Eppendorf de 1,5 ml por un tiempo etílico y ácido acético, 3:1:1) al que se le máximo de 72 h. En ambos casos el mucílago aplicaron luego las técnicas de deshidratación fue puesto en evidencia con soluciones e inclusión en parafina para la obtención acuosas de azul de metileno al 0,05% y azul de cortes microtómicos de 10 a 14 µm. Las brillante de cresilo al 1%. El ancho del halo tinciones fueron realizadas con azul brillante mucilaginoso se determinó por mediciones de cresilo, en solución acuosa al 0,05 % (Pérez directas, expresadas en milímetros. Para et al. 2002), safranina alcohólica al 1% y fast- tipificar la reacción de mixocarpia en las green alcohólico al 0,1% (Martín-Mosquero especies estudiadas se tomaron los parámetros et al. 2004). Posteriormente, se procedió al propuestos por Duletiæ-Lauševiæ & Marin montaje con bálsamo de Canadá (Johansen (1999), a saber: reacción fuerte (mayor de 1940, D’Ambrogio de Argüeso 1986). Para 0,5 mm), moderadamente fuerte (entre 0,1- el estudio del pericarpo las núculas maduras 0,5 mm), débil (menor a 0,1 mm) y muy fueron sumergidas 24 h en agua destilada y débil (menor a 0,05 mm). Para definir las glicerol (90:10) antes de la aplicación de las microesculturas de las núculas se tomaron en técnicas clásicas histológicas. consideración los modelos de Barthlott (1981) y Barthlott et al. (1998). Para el análisis del receptáculo se efectuó la diafanización del mismo desprovisto de Las ilustraciones se realizaron con antófilos estériles y estambres. El diafanizado fotomicroscopio Axiophot Zeiss (MO) y 351 Morfoanatomía de gineceo y fruto en Mentha Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) en el lóbulo más desarrollado del nectario JEOL JSM 35 CF (LABMEM, Universidad (Fig. 3 D, E). Nacional de San Luis) y JEOL 5800 LV a 10 KV (UNNE, Corrientes). Histología del nectario. El tejido nectarífero, 1-5-estratificado, difiere del parénquima RESULTADOS subnectarífero (Fig. 2 A, B). Presenta una epidermis unistrata con células isodiamétricas Morfo-anatomía del gineceo. El ovario pequeñas, cutícula notoria y citoplasma de Mentha es bicarpelar; cada carpelo se denso. Los estomas (nectarostomas) poseen divide por un tabique incompleto en dos células oclusivas abiertas y semejantes en lóculos con sendos óvulos (Fig. 1 A, C, D). tamaño al resto de las células epidérmicas. Una delgada porción de la base del ovario es El parénquima nectarífero consta de células indivisa (Fig. 1 A, B), pues la invaginación alargadas radialmente y dispuestas en de la pared ovárica ocurre en las ¾ partes empalizada, con espacios intercelulares superiores (Fig. 1 C). Cerca de la base de los conspicuos subyacentes a los estomas. Las primordios seminales nace el estilo (Fig. 1 células secretoras presentan citoplasma denso, D); el estigma posee dos ramas estigmáticas granuloso, con núcleos y vacuolas pequeñas desiguales sin papilas. En corte longitudinal (Fig. 2 C). El parénquima subnectarífero por el receptáculo se observan los nudos de consta de células redondeadas de contenido distinta longitud, ubicándose el ovario sobre claro con abundantes cristales y granos de un corto ginóforo (Fig. 1 A, D; Fig. 2 A). almidón. Los hacecillos de conducción no Alrededor del ginóforo y la base del ovario se ingresan al tejido secretor (Fig. 2 B). ubica un nectario (Fig. 1 D; Fig. 2 A-C). En la flor en antesis la pared del ovario posee cinco Características del fruto. El fruto es capas de células indiferenciadas: epidermis tetranuculado que, a la madurez, se divide externa, epidermis interna y tres estratos del en cuatro mericarpios monospermos e mesofilo. La epidermis externa es unistrata, indehiscentes; excepcionalmente maduran las con células más o menos isodiamétricas, cuatro núculas, observándose con frecuencia de paredes delgadas y convexas, en tanto sólo 1-3 por fruto. Las núculas son los órganos que la epidermis interna, también unistrata, de dispersión. presenta células rectangulares de paredes deprimidas radialmente. El mesofilo posee Morfología de las núculas. Las núculas son células prismáticas que van disminuyendo pequeñas, variando entre 0,90-0,70 x 0,70-0,45 de tamaño hacia el estrato más interno. En la mm, de simetría dorsiventral, más o menos epidermis de la porción apical de los carpelos trígonas, entre aovada-ovadas, con base aguda se observan tricomas eglandulares en M. x y ápice redondeado (Fig. 4). En todos los casos rotundifolia y M. citrata (Fig. 3 B, C, F). el hilo está localizado en la base de la núcula. En la cara ventral presenta una pequeña cresta Morfología del nectario. El nectario es un que abarca hasta 1/4 de la núcula, dividiéndola anillo continuo (Fig. 1B, C), poco voluminoso, en dos depresiones sub-hemisféricas (Fig. 4 con un lóbulo ligeramente más desarrollado, B, D, F, G, J); hacia la cara dorsal el hilo tiene opuesto al pétalo inferior de la corola; es de forma subtriangular (Fig. 4 A, C, E, H, I). El tonalidad verdosa, sin un límite definido con límite del hilo es muy marcado en M. x piperita el resto del ovario y del ginóforo (Fig. 2 A, B; (Fig. 4 A, B; Fig. 5 J), M. x rotundifolia (Fig. Fig. 3 A). Los estomas son más bien escasos 4 C, D) y M. spicata (Fig. 4 E), donde las y permanecen con las células oclusivas células limitantes forman un reborde notorio siempre abiertas. Ocupan áreas restringidas (Fig. 5 H); en cambio, este límite es difuso en 352 Bonzani et al. M. citrata (Fig. 4 G; Fig. 5 M) y M. pulegium pulegium, castaño brillante en M. x piperita (Fig. 4 I, J); en esta última especie las células y M. x rotundifolia y castaño-rojizo en M. limitantes presentan notables estriaciones spicata. cuticulares concéntricas (Fig. 5 E). La superficie del hilo está revestida El color de las núculas varía entre las especies, completamente por ceras epicuticulares (Fig. siendo pardo-claro brillante en M. citrata y M. 6 A-E), que le confieren color blanquecino. Figura 1. Gineceo y nectario (MO). AA.. M. pulegium (Bonzani 86), B, C, D. M. citrata (Bonzani 118). A. Receptáculo y gineceo (c/l), B. Región basal del ovario (c/t), C. Región apical del ovario (c/t), D. Gineceo (c/l). Abreviaturas. aov: región apical del ovario, bov: región basal del ovario, c/l: corte longitudinal, cp: cicatriz del perianto, c/t: corte transversal, est: estilo, gy: ginóforo, hv: hacecillo vascular, lo: lóbulo, nec: nectario, ovu: óvulo, sep: septo, ta: tabique carpelar. 353 Morfoanatomía de gineceo y fruto en Mentha Figura 2. Posición e histología del nectario (MO). A, B, C. M. citrata (Ariza Espinar 3420) A. Ubicación del nectario, B. Diferenciación histológica entre el parénquima nectarífero y subnectarífero, C. Detalle del parénquima nectarífero. Abreviaturas. bov: región basal del ovario, ces: células secretoras, cp: cicatriz del perianto, cri: cristales, eps: epidermis secretora, esp: espacio intercelular, esto: estoma, gy: ginóforo, hv: hacecillo vascular, nec: nectario, pas: parénquima subnectarífero, pnec: parénquima nectarífero. 354 Bonzani et al. Figura 3. Gineceo y nectario (MEB). A. M. spicata (Bonzani 88), B, C. M. x rotundofolia (Bonzani 87), D, E. M. x piperita (Bonzani 84), F. M. citrata (Bonzani 118). A. Vista general de gineceo y nectario (flecha), B. Extremo apical del ovario con tricomas eglandulares, C. Detalle de tricomas eglandulares uni-pluricelulares, D. Área del lóbulo nectarífero con nectarostomas (flecha), E. Detalle de nectarostomas, F. Extremo apical del ovario con tricomas eglandulares. Superficie de las núculas (MEB). De epicuticulares determinan la microescultura acuerdo con Barthlott (1981) y Barthlott et terciaria. al. (1998), la superficie epidérmica de las Las microesculturas primarias y secundarias núculas responde a diferentes patrones de observadas en este trabajo responden a los microesculturas: primarias, secundarias y siguientes tipos: terciarias. La microescultura primaria está dada por el contorno de las células, características Tipo 1.- Reticulado-areolado: presenta de las paredes anticlinales (rectas, onduladas o una superficie homogénea, con todas las sinuosas) y la curvatura de la pared periclinal células poliédricas, paredes anticlinales externa (plana, cóncava o convexa). La rectas, altas y anchas que determinan aréolas microescultura secundaria depende del relieve bien definidas, similar a un panal de abejas. de las paredes anticlinales, la presencia o La pared periclinal cóncava, posee débiles ausencia de estriaciones cuticulares y el estriaciones cuticulares paralelas y bifurcadas. engrosamiento secundario de las paredes Este patrón está presente en M. x rotundifolia anticlinales y periclinales; por último, las ceras (Fig. 5 A, B). 355 Morfoanatomía de gineceo y fruto en Mentha Figura 4. Morfología de las núculas (MEB). A, B. M. x piperita (Bonzani 84), C, D. M. x rotundifolia (Bonzani 87), E, F. M. spicata (Bonzani 83), G, H. M. citrata (Bonzani 118), I, J. M. pulegium (Bonzani 86). A, C, E, H, I. Superficie dorsal, B, D, F, G, J. Superficie ventral. Tipo 2.- Reticulado redondeado-radiado: de cuticulares mientras que la pared periclinal superficie homogénea, con todas las células es regularmente cóncava o deprimida, isodiamétricas, netamente redondeadas, con estriaciones paralelas o bifurcadas; a con paredes anticlinales curvadas, anchas y esta variación la denominamos Estriado- levemente sobreelevadas. La pared periclinal acordonado. En M. x piperita (Fig. 5 I) los es irregularmente cóncava, debido a las cordones cuticulares no son muy notorios estriaciones cuticulares radiales que convergen en todas las paredes anticlinales, mientras hacia el centro; este tipo se observa en M. que la pared periclinal es irregularmente pulegium (Fig. 5 C, D). cóncava-convexa, de aspecto abollonado o rugoso, con estrías cuticulares paralelas entre Tipo 3.- Estriado: caracterizado por sí; en este caso la denominamos Estriado- una superficie heterogénea con células abollonado. sub-triangulares entremezcladas con sub- cuadrangulares. Dentro de este tipo se Tipo 4.- Estriado-papilado: de superficie observan dos variantes. En M. spicata homogénea, con predominio de células (Fig. 5 F, G) las paredes anticlinales están cuadrangulares, paredes anticlinales rectas resaltadas por la presencia de cordones y muy marcadas por la presencia de estrías 356 Bonzani et al. paralelas notorias formando cordones. La La microescultura terciaria está representada pared periclinal, irregularmente cóncava- por las ceras epicuticulares en forma de convexa, presenta estrías cuticulares paralelas cristaloide (Fig. 6 A-E), observadas solamente y/o concéntricas (Fig. 5 K), a menudo en las superficies abaxial y adaxial del hilo. interrumpidas por micropapilas (Fig. 5 L). Se diferencian varios tipos estructurales de Este tipo fue observado en M. citrata. cristaloides, tales como gránulos esféricos, sub- Figura 5. Microesculturas de las núculas (MEB). A, B. M. x rotundifolia (Bonzani 87), C, D, E. M. pulegium (Bonzani 86), F, G, H. M. spicata (Bonzani 88), I, J. M. x piperita (Bonzani 88), K, L, M. M. citrata (Ariza Espinar 3421). A. Tipo reticulado areolado, B. Aréolas poligonales, C. Tipo redondeado radiado, D. Estrías cuticulares radiales notables, E. Células con estrías cuticulares concéntricas, F, G. Tipo estriado-acordonado, H, J. Límite marcado entre superficie ventral e hilo, I. Tipo estriado abollonado, K. Tipo estriado papilado; L Micropapila con estrías paralelas, M. Límite difuso entre superficie ventral e hilo. 357 Morfoanatomía de gineceo y fruto en Mentha esféricos y cristaloides cúbicos y filamentosos. superficie tuberculada en M. spicata (Fig. Gránulos esféricos con superficie foraminada 6 F, G). Los cristaloides filamentosos (Fig. sólo se observan en M. pulegium (Fig. 6 A); 6 B) y cúbicos (Fig. 6 E) son escasos y se gránulos esféricos con superficie finamente mezclan con los cristaloides esféricos. Los granulada en M. citrata (Fig. 6 B), M. x filamentosos se observan en todas las especies piperita (Fig. 6 C) y M. x rotundifolia (Fig. mientras que los cúbicos están presentes en M. 6 D); gránulos esféricos y sub-esféricos con citrata, M. x rotundifolia y M. spicata. Figura 6. Morfología de los cristaloides (ceras epicuticulares) MEB. A. M. pulegium (, B. M. citrata, C. M. x piperita, D, E. M. x rotundofolia, F, G. M. spicata. A. Gránulos esféricos con superficie foraminada y cristaloides filamentosos, B. Gránulos esféricos con superficie granulada y numerosos cristaloides filamentosos, C. Gránulos esféricos con superficie granulada, D. Gránulos esféricos con superficie granulada y cristaloides cúbicos, E. Detalle de cristaloides cúbicos, F. Gránulos esféricos y cristaloides filamentosos, G. Detalle de gránulos esféricos y sub-esféricos con superficie tuberculada. 358