TTHHÈÈSSEE En vue de l'obtention du DDOOCCTTOORRAATT DDEE LL’’UUNNIIVVEERRSSIITTÉÉ DDEE TTOOUULLOOUUSSEE Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Cancérologie Présentée et soutenue par Fanny LEMEE Le 12 juin 2009 Titre : Dérégulation de l’expression des ADN polymérases translésionnelles, instabilité génétique et progression des cancers colorectaux et du sein JURY Bernard SALLES PU, IPBS/CNRS-UMR5089, Toulouse Président Patricia KANNOUCHE CR1, Institut Gustave Roussy, Villejuif Rapporteur Jean ROSENBAUM DR, INSERM-U889, Bordeaux Rapporteur Agnès TISSIER CR1, UPR3081 CNRS, Marseille Examinatrice Christophe CAZAUX PU, IPBS /CNRS-UMR5089, Toulouse Directeur de thèse Ecole doctorale : Biologie Santé Biotechnologies Unité de recherche : IPBS/CNRS (UMR5089) Directeur(s) de Thèse : Christophe CAZAUX Rapporteurs : Patricia Kannouche (CR1-CNRS) Jean Rosenbaum (DR-INSERM) Cette thèse n’aurait pu être la même sans la contribution scientifique et le soutien de plusieurs personnes que je souhaite remercier ici. Je souhaite tout d’abord remercier le Pr Salles, le Dr Kannouche, le Dr Rosenbaum et le Dr Tissier pour l’honneur qu’ils m’ont fait d’avoir accepté de faire partie de mon jury de thèse et de juger mon travail. Merci à Christophe Cazaux et Jean-Sébastien Hoffman, co-directeurs de l’équipe IGC, qui m’ont accueillie dans leur équipe et m’ont accordé leur confiance, notamment entre le MR2 et la thèse en s’impliquant activement dans la recherche de financements nécessaires à la réalisation de cette thèse. Je souhaite remercier plus particulièrement Christophe, mon directeur de thèse. J’ai été honorée de la grande confiance que tu m’as accordée durant ces quatre années. Tu m’as laissé la liberté de mes choix dans le développement de ce projet en sachant que l’autonomie et le développement du libre-arbitre sont au final particulièrement formateurs. Merci de m’avoir confié un projet ambitieux et de m’avoir permis de m’impliquer dans toutes les étapes de son développement, de sa conception théorique à sa réalisation pratique, en passant par les mises au point d’outils qui se sont révélées particulièrement fastidieuses, mais qui m’ont conduite à apprécier davantage l’obtention d’un résultat positif ! Merci de m’avoir ainsi donné l’opportunité de travailler dans un contexte pluridisciplinaire riche, en relation étroite avec ce qui m’avait à l’origine conduite à Toulouse et qui reste mon cheval de bataille: la cancérologie. Je te remercie également de m’avoir permis de graver dans ma mémoire la Chine et sa Grande Muraille, St Petersburg et les sensations fortes d’un atterrissage d’urgence ainsi que la Californie et la danse des baleines… Un grand merci à toi, Clarisse. C’est avec toi que tout a débuté. J’ai énormément apprécié travailler à tes cotés sur le projet « promoteurs » qui nous a toutes deux tenu à cœur et que tu m’as si généreusement transmis. Mille mercis Marie pour ton énergie si positive et si communicative qui m’a redonné la pêche plus d’une fois! Merci de m’avoir transmis avec patience et bonne humeur tout ton savoir sur le combing et d’avoir ainsi pu partager en connaissance de cause toutes mes peines, mais aussi mes joies (car il y en a parfois !) relatifs à cette partie du projet. Je te remercie pour tous les bons moments partagés et j’espère que tu viendras vérifier par toi-même si tes prévisions se sont réalisées. Merci Valérie, pour avoir allié tes forces aux miennes sur le projet PolQ, apportant l’aspect clinique au projet. J’ai aimé le partage de nos idées, nos discussions pour essayer de faire avancer le « chmilblick » et ta manière si juste d’analyser les choses. Merci pour ton solide soutien ces derniers mois. Claire et Elena, comment vous remercier pour l’énorme contribution que vous avez apporté au projet PolQ ? Merci pour le temps et l’énergie que vous avez investis sans compter dans ce projet. Travailler avec vous a été pour moi d’un grand réconfort, car on réfléchit bien mieux à deux que tout seul, et nos discussions, nos « brainstormings » du soir ont permis peu à peu de faire mûrir ce projet. J’espère ne pas avoir été trop exigeante comme encadrante, mais vue l’amitié qui nous lie désormais, j’en conclue que vous ne m’en tenez pas trop rigueur. Je vous souhaite bonne chance à toutes les deux pour vos thèses et pour vos projets respectifs. Merci Eddy pour ton aide précieuse ces derniers mois sur les dernières manips du papier PolQ. Tu as su te plonger rapidement dans l’univers de ce projet et y apporter ton savoir-faire et ton efficacité. Merci pour ta gentillesse et ta bonne humeur qui ensoleille les journées au labo. Merci Anne, pour m’avoir transmis ton savoir sur la PCR en temps réel et sur 1001 petites choses du labo. Merci surtout pour ta douceur et ta gentillesse qui m’ont apaisée bien des fois. Merci aux membres de l’équipe IGC, passés et présents, pour vos conseils avisés et les discussions enrichissantes que nous avons pu avoir. François, merci de m’avoir initiée avec patience à la biochimie des protéines et merci pour ton aide précieuse sur cette partie du projet qui n’a malheureusement pas eu de suite. Merci Nadine pour ton aide dans la stratégie de clonage de PolQ ainsi que pour tes nombreux conseils qui m’ont aidée dans mes laborieuses mises au point. Dennis, merci pour tous tes trucs et astuces qui font qu’un protocole fonctionne du premier coup! Yvan, merci pour tes questions déstabilisantes qui m’ont aidée à mieux maitriser mes projets ;) et pour nos discussions, scientifiques ou non. Merci, Anne, de prendre la suite du projet PolQ. Bonne chance avec cette protéine un peu capricieuse, mais si passionnante. Merci Remy pour nos discussions scientifico-politico-bibliographiques, pour m’avoir fait découvrir et aimer le trip-hop et pour toutes les fois où tu m’as fait rire, bien souvent malgré toi. Laurie, ma petite Laurie, je suis heureuse d’avoir pu partager avec toi les joies et peines du labo et surtout durant cette dernière longue ligne droite qui nous a rapprochées. Merci Marlène d’avoir été ma co-équipière de choc dans l’aventure SILAC. Merci de m’avoir ouvert l’esprit à la protéomique avec patience et humour. Le sabotage n’aura pas eu raison de nous ! Merci à mes amis, précieuse soupape de décompression, qui m’ont entourée et chouchoutée. Oriane, merci de toujours avoir été là pour moi et d’avoir supporté avec courage mes craquages migrainogènes du vendredi soir. Marine, merci pour ta joie de vivre et tes pâtisseries salvatrices. Claire, merci pour ces loulous-meetings d’anthologie et ton humour qui a musclé mes zygomatiques. Camille, merci pour nos délires euphorisant. Eva, Anthony, Diane, Corentin, Clémentine et Paul, merci pour tous ces week-ends ressourçant. Soazig et Mélanie, merci pour votre amitié solide et inaltérable par-delà les années et les kilomètres… Merci à ma mère, pour son amour et son soutien inconditionnel et irremplaçable. Merci à mon père, qui est ma leçon de courage et en qui je puise ma force. Pour finir, merci à mon homme, Mathieu, qui chaque jour, avec amour, écarte mes doutes, soigne mes blessures et partage mes joies… merci pour la promesse de ces longues années à venir… Sommaire  Sommaire.............................................................................................................................1 Abréviations........................................................................................................................7 Résumé...............................................................................................................................11 Abstract..............................................................................................................................12 INTRODUCTION.................................................................13 CHAPITRE I – Les ADN polymérases et le maintien de la stabilité du génome.............14 1. Les ADN polymérases réplicatives et la réplication génomique...............................14 1.1 La réplication de l’ADN chez les eucaryotes supérieurs.....................................14 1.1.1 L’initiation et Polα......................................................................................14 a) L’activation des origines..............................................................................16 b) L’initiation de la réplication.......................................................................16 c) L’ADN polymérase alpha (Polα)................................................................17 d) La régulation de l’activation des origines...................................................17 1.1.2 L’élongation et les ADN polymérases Polδ et Polε...................................20 1.1.3 La terminaison.............................................................................................24 1.2 La fidélité de la réplication...................................................................................26 1.2.1 La sélection des nucléotides........................................................................27 1.2.2 L’activité 3’ (cid:198) 5’ exonucléase.....................................................................28 1.2.3 La réparation des mésappariements par le MMR......................................29 2. Les ADN polymérases translésionnelles (TLS) et la gestion des lésions de l’ADN..31 2.1 Les barrières de fourches de réplication..............................................................31 2.1.1 L’ADN structuré..........................................................................................31 2.1.2 Les collisions avec la machinerie de transcription....................................33 - 1 - 2.1.3 Les lésions de l’ADN...................................................................................34 a) Les lésions endogènes..................................................................................35 b) Les lésions exogènes....................................................................................36 2.2 Rôle des ADN polymérases TLS dans la tolérance des lésions............................39 2.2.1 Mono et poly-ubiquitinylation de PCNA..................................................40 2.2.2 Le contournement de la lésion...................................................................43 2.2.3 La synthèse translésionnelle.......................................................................44 a) Contrôle de la synthèse translésionnelle...................................................45 b) Le choix des ADN polymérases translésionnelles.....................................48 2.3 Rôles des ADN polymérases TLS dans la réparation des lésions........................50 2.3.1 Rôles dans la réparation par excision de base et dans la réparation des cassures simple-brin de l’ADN...............................................................................50 2.3.2 Rôles dans la réparation par excision de nucléotides................................53 2.3.3 Rôle dans la réparation des cassures double-brin de l’ADN.....................53 2.4 Caractéristiques et fonctions des ADN polymérases TLS et plus particulièrement de Polη, Polκ et Polθ......................................................................57 2.4.1 Fidélité des ADN polymérases translésionnelles.......................................57 2.4.2 L’ADN polymérase η...................................................................................58 2.4.3 L’ADN polymérase κ...................................................................................60 2.4.4 L’ADN polymérase θ...................................................................................62 3. Régulation de l’expression des ADN polymérases.....................................................66 3.1 Régulation de l’expression des ADN polymérases réplicatives...........................66 3.2 Régulation de l’expression des ADN polymérases translésionnelles..................68 CHAPITRE II- La perturbation de la réplication : Réponses cellulaires et conséquences sur la stabilité du génome..................................................................................................71 1. Le point de contrôle de phase S..................................................................................71 1.1 La voie dépendante d’ATR....................................................................................72 - 2 - 1.1.1 Les mécanismes d’activation d’ATR...........................................................72 1.1.2 La signalisation issue de l’activation d’ATR...............................................75 a) Activation et rôles de Chk1........................................................................75 b) Les autres substrats d’ATR..........................................................................76 1.2 La voie dépendante d’ATM...................................................................................77 1.2.1 Les mécanismes d’activation d’ATM..........................................................78 1.2.2 L’amplification du signal.............................................................................79 1.2.3 La propagation du signal par Chk2.............................................................81 1.3 Inter-conversion de ces deux voies de signalisation...........................................81 2. Rôle des protéines du point de contrôle de phase S lors d’une phase S normale....83 2.1 Régulation de l’initiation et de la progression des fourches de réplication.......83 2.2 Le cas particulier des sites fragiles communs.......................................................84 3. Stress réplicatif et cancer............................................................................................85 Chapitre III- La dérégulation de l’expression des protéines de la réplication comme acteur du développement des cancers et facteur pronostique des cancers colorectaux et mammaires........................................................................................................................89 1. L’instabilité génétique dans le développement tumoral...........................................89 2. Mutations et dérégulations de l’expression des ADN polymérases dans les cancers92 2.1 Mutations et dérégulations d’expression des ADN polymérases réplicatives....92 2.2 Mutations et dérégulation de l’expression des ADN polymérases translésionnelles..........................................................................................................93 3. La réplication de l’ADN comme source de nouveaux marqueurs pronostiques des cancers colorectaux et mammaires.................................................................................99 3.1 Les cancers colorectaux et mammaires................................................................99 3.1.1 Le cancer colorectal....................................................................................99 3.1.2 Le cancer du sein.......................................................................................101 3.2 Détermination d’un facteur pronostique...........................................................103 - 3 - 3.3 Les protéines de la réplication utilisées comme biomarqueurs et facteurs pronostiques des cancers colorectaux et mammaires..............................................105 CHAPITRE IV- Présentation des travaux de thèse........................................................108 RESULTATS........................................................................110 CHAPITRE I- Régulation de l’expression des ADN polymérases TLS Polκ et Polη. Recherche des causes possibles de la dérégulation de Polκ dans les cancers colorectaux. .........................................................................................................................................111 1. Introduction...............................................................................................................111 2. Analyse de l’expression de Polκ et Polη dans les cancers colorectaux..................112 3. Caractérisation d’éléments régulateurs du promoteur de POLΚ impliqués dans la sous-expression de cette polymérase dans les cancers colo-rectaux..........................114 3.1 Publication...........................................................................................................114 3.2 Résultats complémentaires : Effet de p53 sur la transcription de POLK.........123 4. Etude de la régulation transcriptionnelle du gène POLH.......................................124 4.1 Caractérisation du promoteur de POLH............................................................124 4.2 Identification de séquences régulatrices de l’expression de POLH..................125 4.3 Identification de facteurs de transcription régulant l’expression de POLH....127 5. Conclusions et discussion..........................................................................................128 CHAPITRE II- La surexpression de l’ADN polymérase théta (Polθ) dans les cancers du sein : acteur du développement tumoral et facteur de mauvais pronostic....................133 1. Introduction...............................................................................................................133 2. Résultats.....................................................................................................................134 2.1 Publication...........................................................................................................134 2.2 Résultats complémentaires.................................................................................172 2.2.1 Validation de la surexpression de Polθ dans les clones cellulaires.........172 2.2.2 L’expression ectopique de Polθ affecte la prolifération cellulaire et augmente l’apoptose..............................................................................................173 2.2.3 La surexpression de Polθ induit des CDBs de l’ADN..............................174 - 4 - 2.2.4 Les CDBs et la signalisation des dommages induites par la surexpression de Polθ semblent avoir lieu en partie au niveau de sites de réplication anormale. 175 2.2.5 La surexpression de Polθ induit de l’instabilité chromosomique...........177 3. Conclusion et discussion...........................................................................................179 Conclusions et discussion...................................................189 Annexe 1 : La classification TNM...................................................................................197 Annexe 2 : Matériels et méthodes...................................................................................199 1. Lignées cellulaires.....................................................................................................199 2. Clonages.....................................................................................................................199 2.1 Clonage des promoteurs tronqués de POLK et POLH......................................199 2.2 Clonage du cDNA de Polθ..................................................................................201 3. Mutagenèse dirigée des promoteurs de POLK et POLH.........................................203 4. Transfections transitoires et tests luciférase............................................................204 5. Transfections stables.................................................................................................205 6. Mesure de l’expression des transcrits par PCR en temps réel :...............................206 6.1 Extraction d’ARN :..............................................................................................206 6.2 Rétro-transcription :...........................................................................................206 6.3 PCR quantitative en temps réel :........................................................................206 6.4 Analyse des résultats :.........................................................................................207 7. Préparation d’extraits nucléaires..............................................................................207 8. Retard sur gel.............................................................................................................207 9. Extraits protéiques.....................................................................................................209 10. Western Blot............................................................................................................209 11. Calcul du temps de doublement.............................................................................209 12. Etude de l’apoptose..................................................................................................210 13. Analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux...............................................210 14. Immunofluorescence...............................................................................................211 15. Sensibilité aux traitements génotoxiques : clonogénie.........................................212 - 5 - 16. Analyse des plaques métaphasiques.......................................................................212 17. Peignage moléculaire de l’ADN..............................................................................213 17.1 Marquage de l’ADN en cours de réplication et préparation des blocs d’agarose ....................................................................................................................................213 17.2 Peignage.............................................................................................................214 17.3 Immunodétection..............................................................................................214 Annexe 3 : Références bibliographiques.........................................................................216 - 6 - Abréviations  ADN: Acide-Desoxyribo-Nucleique ADNsb: ADN simple-brin AF: Anémie de Fanconi AP: apurinique, ou apyrimidinique ARN: Acide Ribo-Nucleique AT: Ataxia Telangiectasia ATM: ataxia-telangiectasia mutated ATR: ataxia-telangiectasia and RAD3-related ATRIP: ATR Interacting Protein B[a]P: Benzo[a]pyrène BPDE: 7,8-diol-9,10,-epoxide BrdU: Bromo-désoxy-uridine CDB : Cassure Double Brin CDK: Cycline-dependant kinase CGH: Comparative Genomic Hybridization Chk1: checkpoint kinase-1 Chk2: checkpoint kinase-2 CIN: Chromosomal Instability Cis-Pt: cisplatine CPD: Cyclobutane Pyrimidine Dimer CRE: cAMP response element - 7 -