Tuz Stresi Altındaki Kanola Fidelerinde Lipoik Asit ve Salisilik Asit Uygulamalarının Bazı Biyokimyasal Parametreler ve Proteom Değişimleri Üzerine Etkilerinin Araştırılması YÜKSEK LİSANS TEZİ Nermin AKÇALI DANIŞMAN Doç. Dr. Mustafa YILDIZ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Ağustos, 2014 Bu tez çalışması 13.FENED.06 numaralı proje ile Afyon Kocatepe Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. AFYON KOCATEPE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ TUZ STRESİ ALTINDAKİ KANOLA FİDELERİNDE LİPOİK ASİT ve SALİSİLİK ASİT UYGULAMALARININ BAZI BİYOKİMYASAL PARAMETRELER ve PROTEOM DEĞİŞİMLERİ ÜZERİNE ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Nermin AKÇALI DANIŞMAN Doç. Dr. Mustafa YILDIZ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Ağustos, 2014 TEZ ONAY SAYFASI Nermin AKÇALI tarafından hazırlanan “Tuz Stresi Altındaki Kanola Fidelerinde Lipoik Asit ve Salisilik Asit Uygulamalarının Bazı Biyokimyasal Parametreler ve Proteom Değişimleri Üzerine Etkilerinin Araştırılması” adlı tez çalışması lisansüstü eğitim ve öğretim yönetmeliğinin ilgili maddeleri uyarınca 15/08/2014 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği/oy çokluğu ile Afyon Kocatepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman : Doç. Dr. Mustafa YILDIZ İmza Başkan : Prof. Dr. Yasemin EKMEKÇİ Hacettepe Üniversitesi, Fen Fakültesi Üye : Doç. Dr. Mustafa YILDIZ Afyon Kocatepe Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi Üye : Doç. Dr. Azmi YERLİKAYA Dumlupınar Üniversitesi, Tıp Fakültesi Afyon Kocatepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu’nun ........./......../........ tarih ve ………………. sayılı kararıyla onaylanmıştır. ………………………………. Prof. Dr. Yılmaz YALÇIN Enstitü Müdürü BİLİMSEL ETİK BİLDİRİM SAYFASI Afyon Kocatepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; - Tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, - Görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, - Başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, - Atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, - Kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, - Ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. 15.08.2014 Nermin AKÇALI ÖZET Yüksek Lisans Tezi TUZ STRESİ ALTINDAKİ KANOLA FİDELERİNDE LİPOİK ASİT ve SALİSİLİK ASİT UYGULAMALARININ BAZI BİYOKİMYASAL PARAMETRELER ve PROTEOM DEĞİŞİMLERİ ÜZERİNE ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Nermin AKÇALI Afyon Kocatepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Mustafa YILDIZ Bu araştırmada, hidroponik olarak büyütülen kanola (Brassica napus L. cv. Sary) fidelerinde NaCl toleransının arttırılmasında dışsal uygulanan lipoik asit (LA) ve salisilik asidin (SA) koruyucu potansiyelleri incelenmiştir. Bu amaçla, 18 günlük kanola fideleri altı farklı uygulama grubuna (kontrol, LA, SA, NaCl, NaCl+LA ve NaCl+SA) ayrılmış ve 7 gün daha büyütülmüşlerdir. Fidelerin yapraklarına gün aşırı 0.1 mM LA veya SA spreylenmiştir. Uygulamaları takiben fide büyümesi, klorofil içeriği, malondialdehit (MDA) içeriği, prolin içeriği, sistein içeriği, protein olmayan tiyol (NPT) içeriği, antioksidan [askorbat (AsA) ve glutatyon (GSH)] içerikleri ve antioksidan enzimlerin [süperoksit dismutaz (SOD), askorbat peroksidaz (APX), guaiakol peroksidaz (POD) ve katalaz (CAT)] aktivitesi 25 günlük fidelerde belirlenmiştir. Tuz stresi gövde ve kök büyümesi, AsA ve GSH içeriklerini azaltmış, malondialdehit (MDA), prolin, sistein ve NPT içeriklerini ve SOD, POD, CAT ve APX gibi antioksidan enzimlerin aktivitesini arttırmıştır. Bununla birlikte, dışsal LA ve SA uygulamaları fide büyümesindeki NaCl­teşvikli azalmayı hafifletmiş ve MDA içeriğini azaltmıştır. LA ve SA uygulamaları prolin içeriğini etkilememiştir. LA ve SA uygulamaları prolin içeriğini etkilememiştir. Tuz stresi altındaki fidelerde LA ve SA uygulamaları sistein içeriğini daha fazla arttırırken, NPT içeriğini azaltmıştır. Tuz stresi altındaki fidelerde AsA içeriği dışsal LA i uygulamasında daha fazla azalırken, SA uygulaması önemli bir etki göstermemiştir. Tuz stresi altında, sadece SA uygulaması GSH içeriğini arttırmıştır. Tuz stresi altındaki fidelerde dışsal LA ve SA uygulamaları POD ve CAT aktivitelerini arttırırken, APX aktivitesinde azalmaya neden olmuştur. Bu sonuçlar, kısa süreli tuz stresi altında savunma sistemlerini etkileyerek fide büyümesinin arttırılmasında LA’nın en az SA kadar etkili olabileceğini göstermektedir. Bu çalışmanın ikinci basamağında, kanola fidelerinde tuza tolerans mekanizmaları üzerine dışsal uygulanan LA’nın etkisi proteomik yaklaşım kullanılarak araştırılmıştır. Bu amaçla, kontrol, LA, NaCl ve NaCl+LA uygulamalarına maruz kalan kanola fidelerinin yaprak dokularından elde edilen proteinler, iki-yönlü (2-D) jel elektroforez [izoelektrik fokuslama (IEF)/Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAJE)] ve MALDI-TOF/TOF kütle spektrometrisi tanımlanmıştır. İfade profilinde değişiklik gösteren 28 proteinden 22’si tanımlanmıştır. Bu proteinlerin 17’si artan yönde ve 5’i ise azalan yönde düzenlenmiştir. Sadece LA uygulaması ile 5 (fotosistem II reaksiyon merkezi PSB28 proteini, tiyoredoksin M-tip 4, 50S ribozomal protein L12-3, 2-Cys peroksiredoksin BAS1 ve sedoheptulo-1,7-bifosfataz) proteinin ifadesi artan yönde düzenlenmiştir. Bununla birlikte, karbonik anhidraz, magnezyum-şelataz altbirim chli, RuBisCO aktivaz, triozfosfat izomeraz ve tiazol biyosentetik enziminin ifade seviyeleri NaCl stresi veya LA uygulaması tarafından azalan yönde düzenlenmiştir. Tanımlanan proteinlerin fotosentez, enerji metabolizması, stres savunma ve sinyal iletiminde fonksiyon gördüğü belirlenmiştir. Tuz stresi altındaki kanola fidelerinde LA’nın iyileştirici etkilerinin proteomik çalışma ile ortaya konulması tuza tolerans mekanizmalarında proteinlerin fonksiyonlarını değerlendirmede yeni bir bakış açısı sağlamıştır. 2014, xii + 94 sayfa Anahtar kelimeler: Brassica napus L., Lipoik asit, Salisilik asit, Tuz toleransı, Proteomik ii ABSTRACT M.Sc Thesis INVESTIGATION OF THE EFFECTS OF LIPOIC ACID AND SALICYLIC ACID APPLICATIONS ON SOME BIOCHEMICAL PARAMETERS AND PROTEOME CHANGES IN CANOLA SEEDLINGS UNDER SALINITY STRESS Nermin AKÇALI Afyon Kocatepe University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Mustafa YILDIZ In this study, the protective potential of exogenously applied lipoic acid (LA) and salicylic acid (SA) in inducing salinity tolerance in hydroponically grown canola (Brassica napus L. cv. Sary) seedlings. For this purpose, 18 day-old canola seedlings divided into six treatment groups (control, LA, SA, NaCl, NaCl+LA and NaCl+SA), and they were grown another seven days. The leaves of seedlings were sprayed every alternate day with 0.1 mM of LA or SA. Following these treatments, the seedling growth, chlorophyll content, malondialdehyde (MDA) content, proline content, cysteine content, non-protein thiol (NPT) content, antioxidant [ascorbate (AsA) and glutathione (GSH)] contents and activities of some antioxidant enzymes [superoxide dismutase (SOD), guaiacol peroxidase (POD), catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX)] were determined in 25-day-old canola seedlings. Salinity stress decreased the growth of shoots and roots and contents of AsA and GSH, and increased the contents of malondialdehyde (MDA), proline, cysteine and NPT and the activities of antioxidant enzymes such as SOD, POD, CAT and APX. However, exogenous applications of LA or SA alleviated the salt stress-mediated seedling growth and decreased the MDA content. LA or SA applications could not influence the proline content. While the LA and SA applications more increased the cysteine content, decreased NPT content in iii seedlings under salinity stress. Exogenous application of LA further reduced AsA content in salt-stressed seedlings, while SA had no significant impact in this respect. Under salinity stress, only SA application improved the GSH content. Exogenous applications of LA or SA increased the activities of POD and CAT, while these applications caused reduction in the APX activity of the salt-stressed seedlings. These results suggest that under short-term salinity stress, LA is at least as effective as SA for improving growth by influencing defense systems. In the second stage of this study, the influence of exogenously applied LA on the salt tolerance mechanism in seedlings of canola was investigated using proteomic approach. For this purpose, proteins from the leaf tissues of canola seedlings subjected to control, LA, NaCl and NaCl+LA treatments were identified by two-dimensional (2-D) gel electrophoresis [isoelectric focusing (IEF)/Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS/PAGE)] and MALDI-TOF/TOF mass spectrometer. Among the 28 proteins exhibiting alterations in expression pattern, 22 proteins were identified. Among them, 17 proteins were up-regulated and 5 proteins were down-regulated. The expression levels of 5 proteins (photosystem II reaction center PSB28 protein, thioredoxin M-type 4, 50S ribosomal protein L12-3, 2-Cys peroxiredoxin BAS1 and sedoheptulose-1,7-bisphosphatase) were regulated by only LA treatment. However, the expression levels of carbonic anhydrase, magnesium-chelatase subunit chli, RuBisCO activase, triosephosphate isomerase and thiazole biosynthetic enzyme ware down-regulated by NaCl stress or LA application. The identified proteins were involved in various cellular responses and metabolic processes such as photosynthesis, energy metabolism, stress defense and signal transduction. The revealing of the protective roles of LA in canola seedlings under salt stress by proteomics study provides new insight to evaluating protein functions in salt tolerance mechanisms. 2014, xii + 94 pages Keywords: Brassica napus L., Lipoic acid, Salicylic acid, Salinity tolerance, Proteomics iv TEŞEKKÜR Bu araştırmanın konusu, deneysel çalışmaların yönlendirilmesi, sonuçların değerlendirilmesi ve yazımı aşamasında yapmış olduğu büyük katkılarından dolayı tez danışmanım Sayın Doç. Dr. Mustafa YILDIZ’a, araştırma ve yazım süresince yardımlarını esirgemeyen doktora öğrencisi Sayın Hakan TERZİ’ye, her konuda öneri ve eleştirileriyle yardımlarını gördüğüm hocalarıma ve arkadaşlarıma teşekkür ederim. Bu araştırma boyunca maddi ve manevi desteklerinden dolayı aileme de teşekkür ederim. Nermin AKÇALI AFYONKARAHİSAR, 2014 v İÇİNDEKİLER DİZİNİ Sayfa ÖZET ....................................................................................................................................i ABSTRACT ......................................................................................................................... iii TEŞEKKÜR ........................................................................................................................... v İÇİNDEKİLER DİZİNİ ........................................................................................................... vi SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ .................................................................................. ix ŞEKİLLER DİZİNİ .................................................................................................................. x ÇİZELGELER DİZİNİ ........................................................................................................... xii 1. GİRİŞ .............................................................................................................................. 1 2. LİTERATÜR BİLGİLERİ .................................................................................................... 5 2.1 Kanola (Brassica napus L.) Bitkisi ............................................................................ 5 2.2 Lipoik Asit ................................................................................................................ 5 2.3 Salisilik Asit .............................................................................................................. 8 2.3.1 Fizyolojik Rolleri.............................................................................................. 10 2.3.2 Bitki Tuz Toleransında Dışsal Salisilik Asit Uygulaması ................................... 12 2.4 Bitkilerde Tuz stresi ve Proteom Değişimleri ........................................................ 14 2.4.1 Fotosentez ve Solunum Metabolizması ......................................................... 16 2.4.2 Reaktif Oksijen Türlerine (ROT’lar) Karşı Savunma Sistemleri ....................... 17 2.4.3 Tuz Stresine Cevapta Sinyal Yolları ................................................................. 20 2.4.4 İyon Homeostazisi .......................................................................................... 22 2.4.5 Transkripsiyon ve Protein sentezi .................................................................. 24 2.4.6 Hücre İskeleti ve Hücre Çeperi Bileşenleri ..................................................... 25 3. MATERYAL ve METOT ................................................................................................. 28 3.1 Bitki Yetiştirme Koşulları ve Uygulamalar ............................................................. 28 vi