ROMÂNIA MINISTERUL EDUCAŢIEI NAŢIONALE UNIVERSITATEA „VASILE ALECSANDRI” DIN BACĂU   FACULTATEA DE INGINERIE PROGRAMUL DE STUDII DOCTORALE INGINERIA MEDIULUI Calea Mărăşeşti, nr. 157, Bacău 600115     Tel. +40-234-542411, tel./fax +40-234-545753 www.ub.ro;  e‐mail: [email protected]  STUDII ECOTOXICOLOGICE PRIVIND NĂMOLUL DE EPURARE STABILIZAT ANAEROB Conducător de doctorat: Conf. univ.dr.ing. Iuliana Mihaela Lazăr Doctorand: Biolog Dumitra Răducanu BACĂU 2014 1 Cuprins Cuprins ........................................................................................................................................................ 3  Mulțumiri .................................................................................................................................................... 5  Justificarea temei şi prezentarea scopului și a obiectivelor tezei de doctorat .......................................... 7  Structura tezei de doctorat ........................................................................................................................ 8  Capitolul 7. REZULTATELE TESTELOR DE ECOTOXICITATE ALE NĂMOLULUI DE EPURARE STABILIZAT  ANAEROB TRATAT PRIN DIFERITE METODE FIZICO‐CHIMICE LA NIVEL PROCARIOT ‐ BACTERII .............. 11  7.1.Numărul total de agenți patogeni identificați în urma tratamentelor cu radiații ionizante de tip  alfa ........................................................................................................................................................ 11  7.2. Numărul total de agenți patogeni identificați în urma tratamentelor cu radiații ultraviolete ..... 12  7.3. Numărul total de agenți patogeni identificați în urma tratamentelor cu microunde ................... 13  7.4. Numărul total de agenți patogeni identificați în urma tratamentelor cu ultrasunete a nămolului  de epurare stabilizat anaerob .............................................................................................................. 14  7.5. Numărul total de agenți  patogeni identificați în urma pasteurizării ............................................ 15  7.6. Numărul total de agenți patogeni identificați în urma tratamentelor chimice ............................ 15  7.7. Rezultatul antibiogramei pentru tulpinile investigate .................................................................. 18  7.7.1. Rezultatul antibiogramei pentru tulpina E. coli (a) și Salmonella sp (b)......................... 18  7.7.2. Rezultatul antibiogramei pentru tulpinile bacteriene izolate ISO .................................. 19  7.8. Rezultate privind caracterizarea tulpinilor bacteriene izolate din probele de nămol stabilizat  anaerob supuse tratamentului fizic și chimic ....................................................................................... 19  7.9. Analiza spectrală a tulpinilor bacteriene izolate (ISO) din probele de nămol stabilizat anaerob  supuse tratamentului fizic și chimic ..................................................................................................... 20  Capitolul 8. REZULTATELE TESTELOR DE ECOTOXICITATE ALE NĂMOLULUI DE EPURARE STABILIZAT  ANAEROB TRATAT PRIN DIFERITE METODE FIZICO‐CHIMICE LA NIVEL EUCARIOT PLANTE .................... 28  8.1. Rezultatele testelor de ecotoxicitate la ceapă (Allium cepa L.) var. galbenă ................................ 28  8.1.1. Rezultate privind studiul aberațiilor cromozomiale la ceapă (Allium cepa L.) var. galbenă  induse de tratamentele aplicate nămolului de epurare stabilizat anaerob ............................. 28  8.1.2. Rezultate privind datele biometrice obţinute la ceapă (Allium cepa L.) induse de  tratamentele aplicate nămolului de epurare stabilizat anaerob ............................................. 31  8.2. Rezultatele testelor de ecotoxicitate asupra grâului comun soiul Dropia (Triticum aestivum L.) 34  8.2.1. Rezultatele testelor de ecotoxicitate aferente parametrilor biometrici  Variația EC .... 34  8.2.2. Rezultatele testelor de ecotoxicitate aferente parametrilor biometrici. Variația  variabilelor independente ........................................................................................................ 35  8.2.3. Rezultatele testelor de ecotoxicitate aferente parametrilor biochimici analizaţi la grâul  comun (Triticum aestivum L.) soiul Dropia ............................................................................... 40  8.3. Rezultatele testelor de ecotoxicitate asupra speciei Lemna minor L. ........................................... 41  3 8.3.1. Rezultatele investigaţiilor privind testul de ecotoxicitate acută a nămolului de epurare pe  lintiță (Lemna minor L.) ............................................................................................................ 41  8.3.2. Rezultatele investigaţiilor privind variația ariei frondelor la lintiță (Lemna minor L.) în  funcție de tratamente și concentrație ...................................................................................... 42  8.3.3. Rezultatele investigaţiilor privind testul de bioacumulare a metalelor grele (Cd, Cr, Cu,  Ni, Pb, Zn) din nămolul de epurare stabilizat anaerob de către lintiţă (Lemna minor L.) ........ 45  Capitolul 9. REZULTATELE TESTELOR DE ECOTOXICITATE ALE NĂMOLULUI DE EPURARE STABILIZAT  ANAEROB TRATAT PRIN DIFERITE METODE FIZICO‐CHIMICE LA NIVEL EUCARIOT ‐ ANIMALE (Eisenia sp.)  .................................................................................................................................................................. 51  9.1. Rezultatele testelor de supraviețuire ............................................................................................ 51  CAPITOLUL 10. CONCLUZII ....................................................................................................................... 55  10.1. Evaluarea gradului de ecotoxicitate al nămolului de epurare stabilizat anaerob ....................... 55  10.2. Evaluarea gradului de ecotoxicitate al nămolului de epurare stabilizat anaerob tratat  suplimentar .......................................................................................................................................... 55  10.2.1. Tratamentul cu radiaţii ultraviolete UVC ...................................................................... 56  10.2.2. Tratamentul de pasteurizare ........................................................................................ 56  10.2.3. Tratamentul cu ultrasunete .......................................................................................... 56  10.2.4. Tratamentul  cu microunde MW .................................................................................. 57  10.2.5. Tratamentul  de iradiere alfa ........................................................................................ 57  10.2.6. Tratamentele chimice ................................................................................................... 57  10.2.7. Influența concentrației ................................................................................................. 57  Posibilităţi de dezvoltare ulterioară ......................................................................................................... 59  Contribuţii originale .................................................................................................................................. 59  Valorificarea rezultatelor obținute în perioada 2012‐2014: .................................................................... 60  Articole publicate în reviste cotate ISI .................................................................................................. 60  Articole în curs de evaluare pentru publicare în reviste cotate ISI ...................................................... 60  Articol publicat: Proceedings Conferință Internațională ...................................................................... 61  Articole în curs de evaluare pentru publicare în reviste indexate BDI: ................................................ 61  Articole publicate în reviste indexate BDI ............................................................................................ 61  Prezentări în cadrul Conferințelor Naționale și Internaționale: ........................................................... 61  Participare la contracte de cercetare naționale: .................................................................................. 63  Bibliografie ............................................................................................................................................... 64  4 Mulțumiri   Adresez respectoase mulţumiri şi deosebită recunoştinţă doamnei conferenţiar univ.dr. ing. Iuliana Mihaela Lazăr, coordonatoarea ştiinţifică a acestei lucrări, pentru profesionalismul şi atitudinea riguroasă cu care s-a implicat în coordonarea activităţii de cercetare şi în elaborarea acestei teze de doctorat. Mulţumesc distinşilor membri ai comisiei de evaluare, prof.univ.dr.ing. Maria Gavrilescu şi prof.univ.dr. Geta Rîşnoveanu pentru acceptul de a evalua această teză de doctorat şi pentru disponibilitatea de a participa la susţinerea publică. Alese gânduri de mulţumire adresez domnului profesor univ. dr. ing. Valentin Nedeff, pentru observaţiile şi sugestiile oferite pe parcursul perioadei de pregătire a tezei de doctorat, pentru materialul bibliografic pus la dispoziţie, pentru bunăvoinţă şi amabilitate. Doamnei conferenţiar univ dr Irina Ifrim şi doamnei lector univ dr Ioana Ştefănescu care mi-au răspuns cu multă amabilitate, promptitudine şi profesionalism la toate problemele legate de chimie, le adresez sincere mulţumiri. Pentru ajutorul oferit pe toată perioada derulării experimentelor, le mulţumesc în mod deosebit doamnei dr. Ema Maria Faciu şi d-rei drd. Elena Goldan, dar şi tuturor colegilor doctoranzi din cadrul Şcolii doctorale în Ingineria mediului, care mi-au fost alături. De asemenea domnului profesor univ dr.ing. Marius Stamate şi doamnei lector dr. Iuliana Caraman le adresez sincere mulţumiri pentru sprijinul oferit în realizarea şi interpretarea experimentelor fizice. Doamnei ing. Gabriela Horgan şi întregii echipe din cadrul Laboratorului Staţiei de Epurare Bacau le adresez respectoase mulţumiri pentru amabilitatea şi disponibilitatea domniilor sale. Colegilor din Departamentul de Biologie Ecologie şi Protecţia Mediului le adresez multe mulțumiri şi sentimente de profundă recunoştinţă, pentru atmosfera plăcută şi pentru sprijinul necondiţionat oferit în realizarea activităţii de cercetare ştiințifică. Doamnei lector univ. dr. Daniela Nicuţă îi adresez sincere mulţumiri pentru profesionalismul şi amabilitatea cu care a răspuns în realizarea şi interpretarea analizelor citogenetice. Nu în ultimul rând doresc să-mi exprim gratitudinea faţă de familia mea, cei care sunt motivul şi raţiunea mea de a fi. 5 6 Justificarea temei şi prezentarea scopului și a obiectivelor tezei de doctorat   Managementul nămolului constituie o problemă complexă, pe măsură ce standardele de mediu devin tot mai restrictive. Din această perspectivă, activitatea de epurare a apelor uzate trebuie asociată cu acţiunea de valorificare și/sau depozitare controlată a nămolurilor rezultate din proces. În Uniunea Europeană, strategia de mediu privind nămolurile rezultate în urma epurării apelor uzate susţine minimizarea producerii acestora, cât şi implementarea unor metode de tratare cu eficienţă crescută, în vederea reciclării. Încă din etapa de proiectare a stațiilor de epurare, o atenție deosebită este acordată acestui subprodus, costul prelucrării nămolului deținând o pondere substanțială din valoarea costului total de investiție și exploatare. Criteriile socio-economice și legislative sunt alte aspecte de care trebuie să se țină cont în gestionarea corectă a acestor categorii de deșeuri. Obiectivul major al tratării nămolurilor în stația de epurare îl constituie evitarea impactului negativ al poluării mediului și a sănătății umane. Calitatea nămolurilor diferă foarte mult în funcţie de proveniența apelor uzate orăşeneşti ce intră în proces, fiind aproape imposibilă predictibilitatea compoziţiei, implicit a modului de gestionare al acestora. Respectându-se principiului precauției, pentru prelucrarea nămolului de epurare nu pot fi elaborate rețete universal valabile și aplicabile. În contextul dezvoltării durabile se impune necesitatea îmbunătăţirii tehnicilor adoptate în privinţa eliminării și/sau valorificării nămolului de epurare, în concordanţă cu criteriile legislative şi economice specifice fiecărei ţări, utilizarea în agricultură fiind o măsură agreată de Uniunea Europeană ca cea mai bună practică de mediu. În prezent, în cadrul staţiei de epurare din municipiul Bacău, nămolurile sunt valorificate parțial prin producere de biogaz. Gestionarea corectă a problemei nămolurilor rezultate din staţia de epurare Bacău necesită dezvoltarea de strategii cu opţiuni multiple şi diversificate, fiind o provocare atât pentru oficialităţile municipiului, cât şi pentru universităţile sau institutele de cercetare din zonă. Valorificarea nămolurilor în agricultură, silvicultură sau pentru refacerea terenurilor degradate, deşi agreată şi preferată în multe state ale lumii este totodată o metodă vulnerabilă şi controversată, ce necesită încă numeroase explorări interdisciplinare. Deși valoarea fertilizantă a nămolului este recunoscută, valorificarea acestuia întâmpină atât obiecții de ordin igienico- sanitar, cât și de ordin etic datorită prezenței nedorite a metalelor grele și altor categorii de poluanți. În acest studiu ne propunem să evaluăm in situ impactul ecotoxicologic al unui deşeu biodegradabil, respectiv nămolul de epurare stabilizat anaerob, neîncadrat în prezent într-o categorie de folosință din punct de vedere al posibilităţilor de valorificare în România. Acest produs a fost supus suplimentar unor tratamente fizice și chimice şi evaluat din punct de vedere al gradului de ecotoxicitate, din perspectiva valorificării acestuia. Din literatura de specialitate au fost selectate, ca nivel de studiu pentru aceste teste, organizarea celulară de tip procariot (bacteriile) și organizarea celulară de tip eucariot (plante și animale). Scopul principal al acestei teze de doctorat îl reprezintă evaluarea ecotoxicologică a nămolului de epurare stabilizat anaerob. În plan secundar s-a urmărit: a) testarea efectelor ecotoxicităţii induse nămolului de epurare stabilizat anaerob prin aplicarea suplimentară a unor tratamente fizico-chimice; b) evidențierea efectelor ecotoxicologice induse de fiecare tratament aplicat suplimentar. 7 Obiectivele principale ale acestei teze de doctorat sunt următoarele: caracterizarea din punct de vedere ecotoxicologic al nămolului de epurare stabilizat anaerob; realizarea unor tratamente fizice și chimice adecvate pentru igienizarea suplimentară a nămolului de epurare stabilizat anaerob; evaluarea ecotoxicității nămolului de epurare stabilizat anaerob tratat suplimentar pe diferite nivele de organizare ale lumii vii; realizarea de comparații critice privind gradul de ecotoxicitate a nămolului de epurare stabilizat anaerob, în funcție de tratamentul suplimentar aplicat. Obiectivele secundare ale acestei teze de doctorat sunt următoarele:  Identificarea tipurilor de tratamente fizice și chimice cu aplicabilitate în acest domeniu, din literatura de specialitate;  Identificarea celor mai eficiente tratamente fizice (pasteurizare, iradiere cu radiații alfa, ultrasunete, microunde) și chimice (CaO, CaCO , NaOH, uree) din punct de vedere 3 sanogen;  Evaluarea efectelor mutagene ale nămolului de epurare stabilizat anaerob supus tratamentelor la nivel celular pe următoarele plante test: ceapă (Allium cepa L.) varietatea galbenă, grâul comun soiul Dropia (Triticum aestivum L.);  Evaluarea efectelor fitotoxice ale nămolului de epurare stabilizat anaerob la nivelul unor parametri de creștere și dezvoltare pe următoarele plante test: grâul comun soiul Dropia (Triticum aestivum L.) și lintiță (Lemna minor L.);  Evaluarea efectele ecotoxicologice ale nămolului de epurare stabilizat anaerob asupra microorganismelor;  Compararea eficienței tratamentelor fizico-chimice aplicate nămolului de epurare stabilizat anaerob din punct de vedere ecotoxicologic. Structura tezei de doctorat   Teza de doctorat este structurată în trei părți principale, respectiv partea de fundamentare științifică a cercetării, metodologia cercetării și partea de cercetare aplicativă. Cele 10 capitole ale prezentei teze de doctorat însumează un număr de 238 pagini, 99 de figuri, 34 de tabele, 27 relaţii matematice şi 201 referinţe bibliografice. Prima parte de fundamentare științifică a tezei conține trei capitole şi este destinată analizei managementului şi tratamentelor aplicate nămolurilor de epurare provenite de la staţiile de epurare. Gestionarea durabilă a acestor sisteme coloidale complexe, cu o compoziţie eterogenă ce impune cunoaşterea caracteristicilor generale, sunt aspecte prezentate în Capitolul 1. Cantitatea totală de nămol de epurare netratat produsă în România este în continuă creştere, situația pe regiuni reflectând un trend ascendent, constatare ce impune identificarea unor soluţii optime de eliminare sau/și de valorificare ale acestora. În acest context, a fost elaborată o analiză a stadiului cunoașterii, la nivel național şi internațional privind procesele tehnologice și procedeele de tratare la care este supus nămolul de epurare provenit de la staţiile de epurare (Capitolul 2). Pentru a evidenția efectele subacute și nivelele de contaminare ce nu sunt observabile, dar produc leziuni fiziologice sunt utilizați indicatorii de toxicitate. Datorită riscurilor multiple generate de manipularea nămolurilor de epurare, este necesar a fi evaluat potențialul ecotoxicologic prin calcularea indicatorilor specifici, subiect abordat în Capitolul 3 al tezei de doctorat. 8 Partea a II-a conține metodologia cercetării şi este structurată în trei capitole ce prezintă materialele și metodologia specifică studiului ecotoxicității nămolului de epurare stabilizat anaerob, pe diferite nivele de organizare ale lumii vii. În vederea creşterii valorii atribuite nămolului de epurare stabilizat anaerob şi a reintegrării în circuitul natural al materiei, s-au căutat soluţii tehnice suplimentare de tratare. Astfel, în Capitolul 5 sunt descrise tehnicile ce investighează schimbările structurale sau morfologice cauzate de utilizarea nămolului de epurare stabilizat anaerob la nivelul speciei Triticum aestivum L. (grâul comun) soiul Dropia, şi al speciei Lemna minor L.. Testele ecotoxicologice propuse în acest studiu prezintă cu destul de multă claritate impactul nămolului de epurare stabilizat anaerob pe termen scurt (toxicitate acută), dar şi pe termen lung (toxicitate cronică). Analiza de design experimental împreună cu analiza componentelor principale au fost principale instrumentele de analiză statistică a datelor (Capitolul 6). Astfel de metode pot evalua rapid măsura în care efectele induse de anumite tratamente fizice si chimice aplicate nămolului de epurare stabilizat anaerob pot mări sau micşora gradul de toxicitate al produsului testat. Partea a III-a constituie partea de cercetare aplicativă a tezei. Aceasta este organizată pe trei capitole ce sumarizează și discută rezultatele testelor de ecotoxicitate ale nămolului de epurare stabilizat anaerob tratat prin diferite metode fizice și chimice, la nivel: procariot – bacterii (Capitolul 7), la nivel eucariot – plante (Capitolul 8) și la nivel eucariot-animale (Capitolul 9). Cuantificarea gradului de ecotoxicitate este stabilită prin intermediul indicatorilor de output specifici, la nivelul fiecărui organism test utilizat. Nămolul de epurare stabilizat anaerob conține o microfloră patogenă cu risc de transfer în diferite ecosisteme şi cu efecte negative din punct de vedere a durabilităţii şi sustenabilităţii acestora. Aceste efecte se pot manifesta într-un timp scurt, mediu sau pe o durată mare de timp, concomitent cu efectul de bioacumulare al metalelor grele sau a altor categorii de poluanţi. Astfel de studii sunt necesare în calcularea riscului de mediu şi sănătate, în vederea reutilizării acestei categorii de produse reziduale. Teza de doctorat se finalizează cu principalele concluzii generate de investigaţiile efectuate asupra potenţialului toxic al nămolului de epurare stabilizat anaerob, aspect ce nu trebuie neglijat în opţiunile de management ale acestui produs, mai ales în condițiile în care, în prezent, nu există criterii de clasificare în vederea utilizării în agricultură. Sintetizând concluziile prezentate în cadrul acestei teze de doctorat: ,,Studii ecotoxicologice privind nămolul de epurare stabilizat anaerob,, pot fi desprinse următoarele posibilităţi de dezvoltare ulterioară a temei de cercetare: crearea unei baze de date spectrale ale tulpinilor bacteriene izolate cu posibilitatea identificării rapide a acestora; promovarea introducerii testelor ecotoxicologice în criteriile de selecție ale nămolurilor pentru utilizare în diferite domenii; elaborarea unui ghid de realizare a testelor ecotoxicologice pentru testarea altor deșeuri; propunerea unor tratamente de igienizare suplimentare a nămolului de epurare stabilizat anaerob, în cadrul staţiei de epurare. Teza aduce contribuţii originale relevante, atât pentru înțelegerea necesității cuantificării indicatorilor de ecotoxicitate, dar și din perspectiva soluțiilor tehnice privind reducerea gradului de toxicitate al nămolului de epurare stabilizat anaerob. Una dintre contribuțiile originale ale tezei este adaptarea ghidurilor OECD 208 și 227 de testare a substanțelor poluante pentru evaluarea toxicității nămolului de epurare stabilizat anaerob. Propunerea cu privire la introducerea investigaţiilor citogenetice, ca test de importanţă majoră în cadrul studiilor de ecotoxicitate realizate pe nămolul de epurare stabilizat anaerob, cu posibilitatea aplicării şi pe alte categorii de produse, este o altă contribuție originală. Evaluarea rapidă a gradului de toxicitate asociat fiecărui tip de nămol de epurare stabilizat anaerob tratat 9 suplimentar, ca rezultat al analizei spectrale în infraroșu, de asemeni, constituie un alt mod de abordare original. Această teză de doctorat are la bază sinteza cercetărilor realizate pe plan național și internațional în acest domeniu, precum și rezultatele originale ale cercetărilor elaborate de către autoare în perioada 2012-2014, și valorificate astfel:2 lucrări publicate în reviste cotate ISI cu factor de impact, 3 lucrări în evaluare în reviste cotate ISI cu factor de impact și 2 în reviste cotate BDI; 1 lucrare publicată integral în volumul unei conferințe internaționale; 7 lucrări publicate în reviste indexate BDI; 29 lucrări prezentate la conferințe naționale și internaționale; 2 proiecte de cercetare naționale, ca membră în colectiv. Notă: La redactarea rezumatului s-au păstrat aceleași notații pentru capitole, paragrafe, figuri, tabele și ecuații utilizate în textul tezei de doctorat. 10