UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE QUÍMICA Programa de Pós-Graduação em Química EXPLORAÇÃO DA DEGRADAÇÃO DE SULFITO ASSISTIDA POR ULTRA-SOM PARA A DETERMINAÇÃO INDIRETA DE AÇÚCARES REDUTORES EMPREGANDO ANÁLISE POR INJEÇÃO SEQÜENCIAL ANTONIO INÁCIO SANTIAGO NETO Orientador: Prof. Dr. Mauro Korn Dissertação apresentada ao Instituto de Química da Universidade Federal da Bahia para obtenção de título de Mestre em Ciências Naturais - Química. Salvador, BA 2006 Antonio Inácio Santiago Neto Universidade Federal da Bahia AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar quero agradecer à força maior, que mesmo latente, às vezes nos impulsiona sempre para frente de forma que alcancemos os nossos ideais. Gostaria de agradecer também: ♦ Ao meu pai, minha mãe, irmãos e demais familiares que sempre acreditaram em mim e que me ajudaram em todos os momentos da minha caminhada. ♦ Aos meus amigos e colegas de laboratório Sonofia: Josué, Enaldo, Sílvia, Daniel, Vitória, Tiago, Zé Tiago, Eduardo, Rodolfo, Márcia, Soledad, Lucas, Totonho, e os demais IC do prédio especial pela amizade, apoio e por tornar este ambiente tão agradável no desenvolvimento desta dissertação. ♦ Aos meus amigos Sivan, Fábio Ole, Vanjo que colaboraram e contribuíram de forma moral e experimental no andamento deste trabalho. ♦ Ao meu orientador, Mauro Korn, pelo incentivo, dedicação e enriquecimento do trabalho através das discussões durante o desenvolvimento deste trabalho. ♦ Aos funcionários e amigos da UNEB e UFBA, que de alguma forma contribuíram para a finalização desta dissertação. ♦ Aos professores Madson, Marta, pela colaboração na caminhada deste trabalho. ♦ A CAPES por conceder bolsa durante a execução deste trabalho. 2 Antonio Inácio Santiago Neto Universidade Federal da Bahia RESUMO Métodos para a determinação de açúcares redutores totais em alimentos explorando a técnica de análise em fluxo têm sido reportados na literatura. Na estrutura dos açúcares redutores há um grupo carbonila capaz de formar adutos com S(IV) em pH entre 4 e 5. No presente trabalho, a concentração de açúcares redutores totais foi determinada monitorando a concentração dos íons sulfito ligados a grupos carbonílicos empregando a técnica de análise por injeção seqüencial. A p-rosanilina foi empregada para a monitoração espectrofotométrica do sulfito ligado a 580 nm. Foi observado que o excesso de sulfito foi oxidado prontamente a sulfato por radicais hidroxila produzidos durante irradiação ultra- sônica como também o tratamento de ultra-som foi incapaz de decompor os adutos. Os adutos foram decompostos pela alcalinização da zona da amostra. O sistema SIA foi desenvolvido para determinação de açúcares redutores totais na -6 -4 -1 faixa de concentração de 6,0x10 a 1,0x10 mol L . O limite de detecção de -7 -1 açúcares redutores totais foi de 6,5x10 mol L e o desvio padrão relativo para 10 determinações consecutivas foi menor que 2%. A concentração de açúcares redutores totais em soro glicosado foi determinada pelo método proposto e os resultados foram comparados ao método de referência, não apresentando diferença significativa para um nível de confiança de 95%. Palavras chave: sistema de análise por injeção seqüencial, açúcares redutores, ultra-som, determinação de sulfito. 3 Antonio Inácio Santiago Neto Universidade Federal da Bahia ABSTRACT Methods for the determination of total reducing sugars in food and beverage by exploiting flow techniques have been reported. In the structure of all reducing sugars has a carbonyl group leading to produce adducts with hydrogen sulfite ions at pH range of 4 - 5. In the present work the concentration of total reducing sugars was determined by monitoring the sulfite ions bonded to carbonyl groups of analyte by sequential injection analysis (SIA) technique. The p-rosaniline was used in the SIA procedure for sulfite determination at 580 nm. It was observed that the excess of sulfite was readily oxidized to sulfate by hydroxyl radicals produced during ultrasonic irradiation as well as the ultrasound treatment was unable to decompose the adducts. The adduct was decomposed by alkalinizing the sample zone. The SIA procedure was developed for determination of total reducing sugars in the -6 -4 -1 - range of 6,0x10 – 1,0x10 mol L . The limit of detection was calculated at 6,5x10 7 -1 mol L and relative standard deviation was less than 2% (N= 10). The concentration of total reducing sugar in food and beverage samples were also determined by reference methods and the results were not significantly different at the 95% confidence level. Keywords: sequential injection analysis, reducing sugars, ultrasound, determination of sulphite. 4 Antonio Inácio Santiago Neto Universidade Federal da Bahia SUMÁRIO Lista de Figuras 7 Lista de Tabelas 9 1.0 Introdução 10 1.1 Processos para determinação de Açúcares Redutores 10 1.2 A Química do S (IV) 15 1.3 Análises em Fluxo 21 1.3.1 Análise por Injeção Seqüencial (SIA) 23 1.4 Considerações sobre Efeitos Químicos dos Ultra-sons 25 2.0 Objetivos 28 2.1 Objetivos Gerais e Específicos 28 3.0 Experimental 29 3.1 Reagentes e Soluções 29 3.2 Equipamentos 31 3.3 Sistema SIA 32 4.0 Resultados e Discussão 34 4.1 Avaliação do Efeito do Ultra-som sobre Adutos de S(IV) 34 4.2 Otimização do Procedimento de Análise por Injeção Seqüencial 40 4.2.1 Efeito do volume de amostra injetado 40 5 Antonio Inácio Santiago Neto Universidade Federal da Bahia 4.2.2 Efeito do volume de reagente 41 4.2.3 Concentração de NaOH 42 4.2.4 Ordem de adição dos reagentes 43 4.2.5 Forma de Inserção de Reagentes e Amostras 44 4.2.6 Efeito do Número de Ciclos para Misturas 44 4.3 Avaliação de Interferentes 45 4.4 Figuras de Mérito 47 4.5 Aplicação 48 5.0 Potencialidades e Perspectivas Futuras 50 6.0 Conclusão 51 7.0 Referências Bibliográficas 53 6 Antonio Inácio Santiago Neto Universidade Federal da Bahia LISTA DE FIGURAS 1.0 Introdução 1.1 Estrutura da glicose e frutose 10 2+ 1.2 Mecanismo da reação de glicose com Cu (Teste de Fehling) 10 1.3 Distribuição das espécies de sulfito em função do pH 16 1.4 Espécies isoméricas do ácido sulfuroso 17 1.5 Representação dos equilíbrios de malvidin 3-O-glucosídeo (1) 18 1.6 Reação do sulfito com a P - rosanilina em meio ácido 19 1.7 Reagentes orgânicos empregados para determinação de sulfito 21 1.8 Representação esquemática de uma montagem FIA 22 1.9 Representação das zonas dos reagentes e amostra 23 1.10 Representação Esquemática de uma montagem SIA 24 3.0 Experimental Reação de derivatização dos aldeídos com 2,4-DNPH em meio 3.1 ácido 30 Representação Esquemática de uma montagem SIA empregada 3.2 32 4.0 Resultados e Discussão 7 Antonio Inácio Santiago Neto Universidade Federal da Bahia 4.1 Cromatograma dos adutos para diferentes tempos de sonicação 34 - 4.2 Perfil de degradação de solução de sulfito[HSO3 ] = 20 mg/ L 37 - 4.3 Perfil de degradação de solução de sulfito[HSO3 ] = 10 mg/ L 37 4.4 Variação do pH da solução de S(IV) com o tempo de sonicação 38 4.5 Efeito do volume de amostra injetado sob o sinal analítico 41 4.6 Avaliação do volume de p-rosanilina injetado 42 4.7 Avaliação da influência do número de ciclos de mistura na reação 45 4.8 Degradação de ácido ascórbico em solução aquosa 46 4.9 Curva analítica para determinação de açúcares redutores 48 8 Antonio Inácio Santiago Neto Universidade Federal da Bahia LISTA DE TABELAS 1.0 Introdução 1.1 Métodos para determinação de açúcares redutores 12 3.0 Experimental 3.1 Passos envolvidos na determinação de sulfito pelo sistema SIA proposto 33 4.0 Resultados e Discussão Resultados obtidos pelo monitoramento de formaldeído para avaliar a 4.1 estabilidade do aduto formaldeído-sulfito 35 Resultados obtidos pelo monitoramento de sulfito para avaliar a 4.2 estabilidade do aduto formaldeído-sulfito 35 Estabilidade dos adutos de glicose-sulfito sob exposição as ondas 4.3 ultrasônicas 36 4.4 Efeito da concentração de NaOH na quebra do aduto 43 4.5 Efeito da ordem de adição dos reagentes e amostras 43 4.6 Comparação das formas de inserção dos reagentes e amostras 44 4.7 Avaliação da interferência de ácido ascórbico 47 4.8 Resultados obtidos com o método proposto (SIA) e com o método de 49 referência 9 Antonio Inácio Santiago Neto Universidade Federal da Bahia 1.0 INTRODUÇÃO 1.1 Processos para Determinação de Açúcares Redutores Os monossacarídeos glicose e frutose são açúcares redutores por possuírem grupos carbonílicos capazes de se oxidarem na presença de oxidantes moderados, 3+ 2+ como Fe ou Cu em soluções alcalinas (Lehninger et al, 2000). As estruturas destes monossacarídeos são apresentadas na Figura 1.1. Figura 1.1 Estrutura da glicose e frutose Como a sacarose contém em sua estrutura dois resíduos de monossacarídeos que comprometem seus grupos anoméricos, esse dissacarídeo não apresenta propriedade redutora. Esta característica redutora de alguns açúcares é à base do método de Fehling (Figura 1.2), o qual permite identificar a presença de açúcares redutores em diferentes amostras (Stryer et al, 2001). 2+ Figura 1.2 Mecanismo da reação de glicose com Cu (Teste de Fehling). 10