Tesis Doctoral CCaappttuurraa nneeuuttrróónniiccaa eenn bboorroo ((BBNNCCTT)) ppaarraa eell ttrraattaammiieennttoo ddeell ccáánncceerr bbuuccaall:: ddeessaarrrroolllloo ddee nnuueevvaass mmooddaalliiddaaddeess ddee BBNNCCTT,, eevvaalluuaacciióónn ddee ssuu rraaddiioobbiioollooggííaa,, eeffiiccaacciiaa tteerraappééuuttiiccaa yy ppootteenncciiaall rraaddiioottooxxiicciiddaadd eenn uunn mmooddeelloo ddee hháámmsstteerr Molinari, Ana Julia 2013 Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Cita tipo APA: Molinari, Ana Julia. (2013). Captura neutrónica en boro (BNCT) para el tratamiento del cáncer bucal: desarrollo de nuevas modalidades de BNCT, evaluación de su radiobiología, eficacia terapéutica y potencial radiotoxicidad en un modelo de hámster. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Cita tipo Chicago: Molinari, Ana Julia. "Captura neutrónica en boro (BNCT) para el tratamiento del cáncer bucal: desarrollo de nuevas modalidades de BNCT, evaluación de su radiobiología, eficacia terapéutica y potencial radiotoxicidad en un modelo de hámster". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2013. DDiirreecccciióónn:: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. CCoonnttaaccttoo:: [email protected] Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293 UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Captura neutrónica en boro (BNCT) para el tratamiento del cáncer bucal: desarrollo de nuevas modalidades de BNCT, evaluación de su radiobiología, eficacia terapéutica y potencial radiotoxicidad en un modelo de hámster Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas Ana Julia Molinari Director de tesis: Amanda Elena Schwint Consejero de estudios: Lilia Lauría Lugar de Trabajo: Comisión Nacional de Energía Atómica Buenos Aires, 2013 Captura neutrónica en boro (BNCT) para el tratamiento del cáncer bucal: desarrollo de nuevas modalidades de BNCT, evaluación de su radiobiología, eficacia terapéutica y potencial radiotoxicidad en un modelo de hámster La Captura Neutrónica en Boro (BNCT) es una terapia binaria que se basa en la acumulación selectiva de compuestos borados dentro del tumor y la subsiguiente irradiación con neutrones térmicos. La reacción de captura que se produce entre el 10B y los neutrones genera partículas letales de corto alcance que dañan el tumor sin causar daño significativo al tejido normal. Previamente en nuestro laboratorio se reportó el éxito terapéutico de una única aplicación de BNCT mediada por los compuestos borados borofenilalanina (BPA), decahidrodecaborato de sodio (GB-10) o la administración combinada de ambos, para el tratamiento del cáncer bucal en un modelo de hámster. Si bien los resultados en términos de eficacia terapéutica fueron muy buenos, pueden ser mejorados. En este trabajo de tesis, buscamos optimizar la terapia de BNCT potenciando el control tumoral y minimizando su radiotoxicidad. Para ello desarrollamos una nueva modalidad terapéutica denominada BNCT secuencial (BPA-BNCT seguido de GB-10-BNCT luego de 24 ó 48 horas), establecimos un método para inducir la normalización de los vasos sanguíneos tumorales (con talidomida) y evaluamos el efecto de esta normalización en la eficacia terapéutica del BNCT mediado por BPA. Complementariamente estudiamos la combinación de ambas modalidades (normalización con talidomida y BNCT secuencial). Asimismo, realizamos un análisis exhaustivo de los posibles cambios en la microdistribución de los compuestos borados por autorradiografía neutrónica. En el presente estudio demostramos que el BNCT secuencial mejora el control del cáncer bucal, que el tratamiento previo con talidomida aumenta la eficacia terapéutica del BNCT mediado por BPA a través de la normalización de los vasos sanguíneos aberrantes del tumor, y que con el tratamiento con talidomida previo al BNCT secuencial se alcanza una respuesta tumoral total (respuesta completa + parcial) del 100% de los tumores. Además, en todos los casos se redujo la radiotoxicidad en el tejido precanceroso circundante al tumor. PALABRAS CLAVES: terapia por captura neutrónica en boro (BNCT), cáncer bucal, bolsa de la mejilla del hámster, normalización, mucositis, autorradiografía neutrónica. 2 Boron Neutron Capture Therapy (BNCT) for the treatment of oral cancer: development of new BNCT protocols, evaluation of radiobiology, therapeutic efficacy and radiotoxicity in a hamster model Boron Neutron Capture Therapy (BNCT) is based on targeting of tumor cells with boron compounds followed by irradiation with thermal neutrons. The capture reaction that occurs between the 10B and the neutrons generates short-range lethal particles that destroy the tumor cells but spare normal tissue. We previously reported the therapeutic success of a single application of BNCT mediated by boronophenylalanine (BPA), decahydrodecaborate (GB-10) or by the combined administration of BPA and GB-10, for the treatment of oral cancer in the hamster cheek pouch experimental model. These previous BNCT studies showed marked therapeutic efficacy but left room for improvement. In this thesis, we explored the way to improve the therapeutic effect without causing unacceptable toxicity in normal or dose-limiting precancerous tissue. Here we developed a novel approach to BNCT termed Sequential BNCT based on the sequential application of BPA-BNCT followed by GB-10-BNCT with an interval of 24 or 48 h between the two treatments. We developed a technique to normalize aberrant blood vessels with thalidomide and assessed its effect prior to the administration of BPA on the therapeutic efficacy of BNCT. As a third new protocol we studied the combination of both modalities, thalidomide treatment prior to Sequential BNCT. Additionally, we performed an autoradiography analysis to explore potential changes in boron microdistribution and content that are not detectable by gross boron measurements. We can conclude based on the observations reported in this thesis that Sequential BNCT enhanced tumor response, that the pretreatment with thalidomide prior to BNCT mediated by BPA was therapeutically beneficial, and that tumor blood vessel normalization before Sequential BNCT controlled the entire population of tumors. For all the new protocols, no extra cost in terms of mucositis in the dose-limiting precancerous tissue was observed. KEYWORDS: Boron Neutron Capture Therapy (BNCT), oral cancer, hamster cheek pouch, normalization, mucositis, autoradiography. 3 Agradecimientos A Mandy por haberme dado la oportunidad de realizar esta tesis. A Verónica, Emiliano, Andrea y Marcela. A Lisien por tantas palabras de aliento y haberme apoyado hasta el final de este trabajo. A Gisele por el tiempo y dedicación que le otorgó a las autorradiografías, por tantas charlas y buenos momentos compartidos. A Agus por su dedicación al trabajo, por ayudarme generosa e incondicionalmente, por ser mi colaboradora y maestra, pero fundamentalmente por ser mi amiga. Sin ella nunca se hubiera concretado una gran parte de este trabajo. A Mariel y Romina por la colaboración con la histo-patología. Al Dr. Cabrini por su generosidad a la hora de transmitir y compartir sus conocimientos conmigo. A Daniel por su asesoramiento y confianza. A Silvia y Paula por toda la ayuda brindada durante las irradiaciones, y por el profesionalismo con que se desempeñan. A María Teresa por la paciencia que tuvo enseñándome y ayudándome con los temas administrativos. A Euge y Sabri por el café de todas las mañanas, pero especialmente por los buenos momentos compartidos que siempre me ayudaron a levantar el ánimo. A Moni por su optimismo hacia mi trabajo y ayuda académica. A Triquim S.A. y el Laboratorio Lazar por haber confiado en nuestro proyecto y proveernos gratuita y gentilmente la Talidomida. A Nico por haberme alentado a realizar el doctorado, por acompañarme desde los inicios de mi carrera, por seguir siendo mi amigo a pesar de las distancias, y por enseñarme todo lo referente al sistema. A mi marido y gran amor, Luis Otegui, por haberme dado buenas ideas, por compartir su conocimiento con nuestro grupo de trabajo, por haberme enseñado las técnicas quirúrgicas necesarias, por ayudarme a sobrellevar los momentos más difíciles, por darme buenos consejos, y fundamentalmente por haberme aguantado estoicamente durante todos estos años de trabajo. Especialmente a mi madre, por haberme inculcado los valores, la rectitud y tenacidad que resultaron fundamentales para mi labor científica, y fundamentalmente por haberme enseñado a enfrentar la vida hasta en el contexto más adverso. 4 A mi familia, la de siempre y la más reciente. 5 Índice Publicaciones……………………………………………………………………………………………………………. 8 Listado de abreviaturas y acrónimos …………………………………………………………………………… 9 INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………………………… 10 1. Terapia por Captura Neutrónica en Boro (BNCT) …………………………………………………. 11 2. Fuentes de neutrones ..………………………………………..………………………………………….. 15 3. Radiobiología …………………………………………………………………………………………………… 18 4. Compuestos borados ………………………………………………………………………………………… 21 5. Cáncer …………………………………………………………………………………………………………….. 30 5.1 Cáncer de cabeza y cuello …………………………………………………………………………… 33 5.2 Mucositis …………………………………………………………………………………………………… 37 6. Modelos Animales …………………………………………………………………………………………….. 41 6.1 Modelo de cáncer bucal de la bolsa de la mejilla del hámster …………………………. 43 7. Historia y antecedentes clínicos de BNCT ……………………………………………………………. 47 7.1 Tumores cerebrales malignos ………………………………………………………………………. 48 7.2 Melanomas cutáneos ………………………………………………………………………………….. 52 7.3 Tumores de cabeza y cuello ………………………………………………………………………… 53 7.4 Otras patologías …………………………………………………………………………………………. 55 8. Proyecto BNCT en la Comisión Nacional de Energía Atómica ……………………………...... 56 OBJETIVOS GENERALES ………………………………………………………………………. 60 OBJETIVOS ESPECÍFICOS …………………………………………………………………… 61 MATERIALES Y MÉTODOS.…………………………………………………………………….. 63 1. Inducción de tumores en la bolsa de la mejilla del hámster y cuidado de los animales 64 2. Preparación de soluciones de boro …………………………………………………………………….. 65 3. Estudios de biodistribución ………………………………………………………………………………… 66 3.1 Biodistribuciones con BPA ……………………………………………………………………………. 67 3.2 Biodistribuciones con GB-10 ………………………………………………………………………… 67 3.3 Biodistribuciones con BPA + GB-10 ………………………………………………………………. 67 4. Valoración de Boro …………………………………………………………………………………………… 68 4.1 Espectrometría de Emisión Óptica con Plasma Inductivo (ICP-OES) ………………… 68 4.2 Espectrometría de Masas con Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-MS) .……. 70 4.3 Autorradiografía neutrónica …………………………………………………………………………. 71 5. Tratamiento con talidomida …………………………………………………………………………….… 73 6. Ensayo de permeabilidad de vasos sanguíneos ……………………………………………………. 74 7. Morfología de vasos sanguíneos ………………………………………………………………………… 76 8. BNCT in vivo ……………………………………………………………………………………………………. 77 8.1 BNCT secuencial ………………………………………………………………………………………… 79 8.2 “Normalización” de vasos sanguíneos tumorales en BNCT ………………………………. 80 8.3 “Normalización” de vasos sanguíneos tumorales + BNCT secuencial ……………….. 82 9. Seguimiento post BNCT …………………………………………………………………………………….. 82 6 9.1 Evolución natural de la enfermedad………………………………………………………………. 83 10. Evaluación de la Mucositis ……………………………………………………………………………….. 84 11. Análisis estadístico ………………………………………………………………………………………….. 85 CAPÍTULO 1 ………………………………………………………………………………………. 86 BNCT SECUENCIAL 1. Introducción ……………………………………………………………………………………………………. 87 2. Resultados ………………………………………………………………………………………………………. 90 3. Discusión …………………………………………………………………………………………………………. 101 CAPÍTULO 2 ………………………………………………………………………………………. 105 NORMALIZACIÓN DE VASOS SANGUÍNEOS TUMORALES 1. Introducción ……………………………………………………………………………………………………. 106 2. Resultados ………………………………………………………………………………………………………. 113 2.1 Estudios de toxicidad ………………………………………………………………………………….. 113 2.2 Examinación macroscópica y microscópica de la bolsa …………………………………… 114 2.3 Ensayo de permeabilidad vascular ……………………………………………………………….. 115 2.4 Morfología de los vasos sanguíneos ……………………………………………………………… 116 2.5 BNCT in vivo ……………………………………………………………………………………………… 117 3. Discusión …………………………………………………………………………………………………………. 126 CAPÍTULO 3 ………………………………………………………………………………………. 132 COMBINACIÓN DE LA NORMALIZACIÓN DE VASOS SANGUÍNEOS CON BNCT SECUENCIAL 1. Introducción ……………………………………………………………………………………………………. 133 2. Resultados ………………………………………………………………………………………………………. 134 3. Discusión …………………………………………………………………………………………………………. 145 CAPÍTULO 4 ………………………………………………………………………………………. 149 ANÁLISIS POR AUTORRADIOGRAFÍA NEUTRÓNICA 1. Introducción ……………………………………………………………………………………………………. 150 2. Resultados ………………………………………………………………………………………………………. 158 2.1 BNCT secuencial ………………………………………………………………………………………… 158 2.2 Tratamiento con talidomida …………………………………………………………………………. 170 2.3 Tratamiento con talidomida + BNCT secuencial …………………………………………….. 172 3. Discusión …………………………………………………………………………………………………………. 176 3.1 BNCT secuencial ………………………………………………………………………………………… 176 3.2 Tratamiento con talidomida …………………………………………………………………………. 179 3.3 Tratamiento con talidomida + BNCT secuencial …………………………………………….. 180 DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES ………………………………………………… 182 REFERENCIAS …………………..……………………………………………………………….. 196 7 Publicaciones Este trabajo de tesis dio lugar a 3 publicaciones en revistas internacionales con referato de pares: "Sequential" boron neutron capture therapy (BNCT): a novel approach to BNCT for the treatment of oral cancer in the hamster cheek pouch model. Molinari AJ, Pozzi EC, Monti Hughes A, Heber EM, Garabalino MA, Thorp SI, Miller M, Itoiz ME, Aromando RF, Nigg DW, Quintana J, Santa Cruz GA, Trivillin VA, Schwint AE. Radiat Res. 2011; 175(4):463-72. Tumor blood vessel "normalization" improves the therapeutic efficacy of boron neutron capture therapy (BNCT) in experimental oral cancer. Molinari AJ, Pozzi EC, Monti Hughes A, Heber EM, Garabalino MA, Thorp SI, Miller M, Itoiz ME, Aromando RF, Nigg DW, Trivillin VA, Schwint AE. Radiat Res. 2012; 177(1):59-68. Blood vessel normalization in the hamster oral cancer model for experimental cancer therapy studies. Molinari AJ, Aromando RF, Itoiz ME, Garabalino MA, Monti Hughes A, Heber EM, Pozzi EC, Nigg DW, Trivillin VA, Schwint AE. Anticancer Res. 2012; 32(7):2703-9. 8 Listado de abreviaturas y acrónimos 4 NQO: tetradecanoilforbol IFP: presión de fluido intersticial AQL: autorradiografía neutrónica cualitativa IO-BNCT: BNCT intra operatorio AQT: autorradiografía neutrónica cuantitativa JRR4: Japan Research Reactor 4 BHE: barrera hematoencefálica KURR: Kyoto University Research Reactor BNCT: Boron Neutron Capture Therapy ó LET: transferencia lineal de energía Terapia por Captura Neutrónica en Boro MIT: Massachusetts Institute of Technology BNL: Brookhaven National Laboratory MPM: mesotelioma maligno pulmonar BPA: borofenilalanina NUMF: no unusual microscopic features CBE: eficacia biológica del compuesto OMS: Organización Mundial de la Salud CNEA: Comisión Nacional de Energía Atómica OSCC: carcinoma de células escamosas de la CR-39: marca comercial de PADC cavidad bucal DE: desvío estándar p.c.: peso corporal DMBA: dimetilbenzantraceno PADC: polialildiglicol carbonato DMSO: dimetilsulfóxido PET: tomografía de emisión de positrones DSPC: distearoilfosfatidilcolina PGNAA: activación neutrónica de radiación EBD: colorante Azul de Evans gamma instantánea ó prompt gamma EE: error estándar PMD: tejido con alteraciones potencialmente EGF: factor de crecimiento epidérmico malignas EGFR: receptor del factor de crecimiento PMGs: proliferaciones microvasculares epidérmico glomeruloideas FiR 1: Finnish Reactor 1 RA: relación de aspecto GB-10: decahidrodecaborato de sodio RA-3: Reactor Argentino 3 GBM: glioblastoma RA-6: Reactor Argentino 6 GMPs: proliferaciones microvasculares RBE: eficacia biológica relativa glomeruloideas RNS: especies reactivas de nitrógeno GNPs: nanopartículas coloidales de oro ROS: especies reactivas de oxígeno Gy: Gray SCC: carcinoma de células escamosas Gy-Eq: Gray equivalentes SLCs: cajas pequeñas de Lexan HER2: receptor del factor de crecimiento SSNTDs: detectores de trazas nucleares de epidérmico humano 2 estado sólido i.p.: intraperitoneal TGF: factor de crecimiento tumoral i.v.: intravenoso VADS: vías aéreas digestivas superiores ICP-MS: espectrometría de masas con plasma VEGF: factor de crecimiento vascular de acoplamiento inductivo endotelial ICP-OES: espectrometría de emisión óptica VIH: virus de inmunodeficiencia humana con plasma inductivo 9