Universidade do Algarve Locust bean gum-based microparticles for pulmonary delivery of antibiotics Ana Bernardina Cotrim Dias Alves Dissertação para a obtenção do Grau de Mestre em Ciências Biomédicas Trabalho efetuado sob a orientação de: Professora Doutora Ana Margarida Moutinho Grenha Faro 2015 Universidade do Algarve Locust bean gum-based microparticles for pulmonary delivery of antibiotics Ana Bernardina Cotrim Dias Alves Dissertação para a obtenção do Grau de Mestre em Ciências Biomédicas Trabalho efetuado sob a orientação de: Professora Doutora Ana Margarida Moutinho Grenha Faro 2015 Locust bean gum-based microparticles for pulmonary delivery of antibiotics Declaração de autoria de trabalho Declaro ser a autora deste trabalho, que é original e inédito. Autores e trabalhos consultados estão devidamente citados no texto e constam da listagem de referências incluída. Copyright © 2015 Ana Bernardina Cotrim Dias Alves ______________________________________________________ A Universidade do Algarve tem o direito, perpétuo e sem limites geográficos, e arquivar e publicitar este trabalho através de exemplares impressos reproduzidos em papel ou de forma digital, ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a ser inventado, de o divulgar através de repositórios científicos e de admitir a sua cópia e distribuição com objetivos educacionais ou de investigação, não comerciais, desde que seja dado crédito ao autor e editor. Agradecimentos A realização desta tese, quer a nível do desenvolvimento experimental quer na sua redação, só foi possível, com a colaboração e disponibilidade de todo um conjunto de pessoas, de que uma forma mais ou menos direta, me apoiaram durante este percurso. A Professora Ana Grenha, orientadora desta Tese, Principal Investigador e líder do grupo Drug Delivery Laboratory, pela oportunidade que me deu, de ter apostado em mim, mesmo antes de acreditar ser possível chegar até aqui. Serei sempre grata pela sua disponibilidade em me orientar e ensinar, permitindo-me a aprendizagem de novos conhecimentos, e “saberes práticos”. Como também a sua receptividade, a compreensão, a preocupação e a cooperação durante todo este processo. A Professora Ana Costa, pela sua ajuda preciosa na área da Química Orgânica, permitindo o desenvolvimento das formulações, ensaios de quantificação de fármacos e de reações de síntese de polímeros. Como também o seu espirito crítico e cooperativo no sentido de se poder sempre melhorar os resultados obtidos. A Investigadora Manuela Gaspar, pela sua disponibilidade em nós receber e orientar nas determinações de densidade real, realizadas na Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa. Bem como a também a sua cooperação e preocupação durante a estadia nesta faculdade. Ao Professor Jorge Martins, pela sua cooperação em nos ajudar a interpretar os resultados de citometria de fluxo. Ao Professor João Lourenço, pela sua ajuda e disponibilidade nas análises de XRD, assim, como as suas explicações sobre os resultados obtidos. A Susana, a sua ajuda, cooperação e amizade, merece um especial destacamento. Há tanto a agradecer, partilhamos tantos “porquês”, “conhecimentos”, “desenvolvimentos”, “impasses”, “ resultados”… Obrigado pela paciência, ensinamentos e companheirismo. A Joana, por ter tido a disponibilidade e a vontade de apreender mais, e ao mesmo tempo, com a sua ajuda, prática e conhecimentos, ter-me ajudado a desenvolver e testar as novas abordagens nas formulações de LBG. Aos meus restantes colegas do laboratório: Jorge, Tatiana, Filipa, Flávia e a Ludmylla. Por terem sempre proporcionado um bom ambiente de trabalho, haver disponibilidade para a troca de saberes, experiências, interajuda e motivação. A Minha Família e Amigos pelo apoio e incentivo incondicional. A todos o meu sincero obrigado… i Resumo A administração de fármacos por via pulmonar tem sido abordada com elevado interesse, conduzindo-se ao crescimento do desenvolvimento de sistemas de libertação específicos para esta via. A sua reduzida atividade enzimática, a prevenção do metabolismo hepático, a superfície elevada, o fino e permeável epitélio alveolar e a vasta rede vascular, tornam-na elegível para a administração sistémica. Mas também, por permitir a elevada deposição de fármaco em elevada concentração numa zona específica do pulmão, permitindo assim, aumentar a sua ação terapêutica, reduzindo a dose total, efeitos adversos sistémicos e efeito de primeira passagem. É largamente utilizada para a veiculação de fármacos para o tratamento local de doenças respiratórias como a asma e fibrose cística, e atualmente investigada para a veiculação de antibióticos para o tratamento de doenças infeciosas, como a pneumonia ou a tuberculose. A tuberculose apresenta ainda uma elevada prevalência e incidência a nível mundial, em 2012, estimou-se o aparecimento de 8.6 milhões de novos casos e 1.3 milhões de casos de mortalidade. Sendo que uma das principais causas de morte é a baixa adesão a terapia oral atual, e consequentemente a falha terapêutica desta. A administração de sistemas que veiculem fármacos antituberculosos tem sido vista como uma abordagem terapêutica que potencialmente será eficaz e segura. Os sistemas micropartículados produzidos, por exemplo, por atomização, tem sido bastantes explorados, devido, a se poderem modular as suas características, de modo, a que exibam características aerodinâmicas adequadas (tamanho geométrico, densidade e forma) para alcançar a região alveolar. A goma de alfarroba (LBG) é um polissacarídeo neutro, que é extraído a partir das sementes de alfarroba, e tem sido largamente utilizado, em aplicações farmacêuticas, devido, a sua baixa citotoxicidade, propriedade bioadesivas e gelificantes. Este polímero pertence a classe dos galactomanamos, e é composto por unidades de mannose e galactose, num ratio aproximadamente de 4/1. A sua estrutura molecular consiste numa ligação linear de unidades (1-4)--mannose com uma unidade de (1-6)-α-galactose. A obtenção de micropartículas com esta estrutura, e com capacidade de atingirem a região alveolar, permite proporcionar o direcionamento destes sistemas para os macrófagos alveolares, onde reside o agente infecioso, Mycobacterium tuberculosis, e permitirem que haja a libertação intracelular dos fármacos veiculados. Este direcionamento deve-se ao facto de os macrófagos alveolares infetados expressarem o receptor da mannose, que ao reconhecer estruturas com mannose, irá conduzir a sua fagocitose, de um modo, mais específico e rápido, comparativamente com sistemas que não tenham esta estrutura. ii Neste contexto, este trabalho propõe o desenvolvimento de sistemas microparticulados, utilizando a goma de alfarroba, para a produção de micropartículas através da técnica de atomização. Pretende-se que este polímero veicule dois fármacos antituberculosos de primeira linha, a isoniazida (INH) e a rifabutina (RFB). Os sistemas microparticulados obtidos serão caracterizados em termos de propriedades aerodinâmicas, de eficácia de encapsulação e capacidade de permitirem a libertação dos fármacos num ambiente alveolar e do fagolisossoma. A sua biocompatibilidade será analisada em duas linhas celulares representativas do epitélio alveolar (A549) e dos macrófagos alveolares (macrófagos diferenciados a partir de THP-1). A capacidade de as partículas com uma matriz de LBG em serem fagocitadas será avaliada na dose de 50 µg/cm2 em duas linhas celulares de macrófagos, macrófagos diferenciados a partir de THP-1 e em macrófagos alveolares provenientes de ratinho (NR8383). A capacidade destas micropartículas em ativarem macrófagos será também avaliada nos macrófagos diferenciados a partir de THP-1. A utilização da goma de alfarroba neste contexto nunca fora descrita anteriormente. Pelo que torna as quatro formulações desenvolvidas com diferentes ratios de fármacos, uma nova abordagem/proposta para a terapêutica de tuberculose, ou a sua potencial adaptação para outra doença infeciosa do trato inferior respiratório. Deste modo as formulações desenvolvidas foram: partículas sem fármaco: Unloaded LBG e partículas com fármaco (ratio polímero:fármaco), LBG.INH 10:1, LBG.RFB 10:0.2, 10:0.5, 10:1 e LBG.INH.RFB 10:1:0.5 e 10:1:1. Apesar de a goma de alfarroba formar dispersões viscosas, devido a não solubilizar por completo, foi necessário a adição de ácido clorídrico (HCl) 0.1 M, para que fosse possível a sua atomização. Permitindo-se assim obter com um rendimento satisfatório (entre 58 a 71%), micropartículas com tamanho adequado para a administração alveolar (entre 1.26 a 1.50 µm). Para além do tamanho adequado, apresentam também valores de densidade real (aproximadamente 1.45 g/cm3) e de diâmetro aerodinâmico (entre 1.27 a 1.90 µm), que indicam a sua capacidade de atingirem a zona alveolar. Apesar de a INH ser um fármaco hidrofílico e a RFB ser um fármaco hidrofóbico, foi possível a sua encapsulação na matriz hidrofílica da LBG, com valores elevados de eficácia de encapsulação (> 82%). Outra justificação para a adição de HCl na formulação, foi a necessidade, de na molécula de RFB, haver um processo de desprotonação, que permitisse a sua solubilização em meio aquoso. O perfil de libertação de INH e RFB foi analisado a partir da formulação LBG.INH.RFB 10:1:0.5, verificando-se a libertação de ambos os fármacos num perfil semelhante em meio com pH 7.4, representativo da região alveolar. O perfil de libertação de INH a partir da formulação de LBG.INH foi avaliado, em dois meios, o representativo da região alveolar, e um representativo do fagolissosoma dos macrófagos, iii pH 5, estrutura formada após a fagocitose da micropartícula, e onde se irá libertar o fármaco. Em ambos os meios se obteve um perfil de libertação rápido de INH. A biocompatibilidade dos fármacos, matéria-prima e sistemas micropartículados produzidos foi avaliada em duas linhas celulares, uma representativa do epitélio alveolar (A549) e outra representativa dos macrófagos alveolares (macrófagos diferenciados a partir de células THP-1). E é feita através da avaliação da atividade metabólica (MTT) e da libertação da enzima lactato desidrogenase (LDH). Os resultados obtidos nos dois testes foram concordantes entre si, e verificou-se que nas concentrações testadas o fármaco RFB é citotóxico, com um índice de concentração que inibe a proliferação/população celular em 50 % (IC ), nestas duas linhas celulares, idêntico aos ratios testados. Apenas formulações que 50 contêm RFB, se observa uma redução da viabilidade celular para estas duas linhas celulares, abaixo, do limite aceitável para formulações farmacêuticas (70%). No polímero observa-se alguma citotoxicidade nas células A549, que não está presente nas Unloaded LBG. Diversas razões foram apresentadas para a explicação desta citotoxicidade da RFB, sendo que por comparação com as Unloaded LBG MPs, se justifica, que a presença de HCl necessário na formulação, em associação com a RFB faz com que exista um efeito sinérgico na redução da viabilidade celular. É proposto a redução do ratio de RFB para um inferior aos desenvolvidos, usar HCl 0.01M para a sua encapsulação, e testar um novo excipiente para a redução da viscosidade da LBG. A biocompatibilidade foi também avaliada, quando os sistemas micropartículados são apresentados em aerossol. As micropartículas selecionadas foram as seguintes: Unloaded LBG, LBG.INH 10:1, LBG.RFB 10:0.5 e LBG.INH.RFB 10:1:0.5 na dose 303 µg/cm2, correspondente à concentração mais elevada em que amostras foram testadas quando apresentadas em solução. As micropartículas foram insufladas sobre uma monocamada de macrófagos alveolares. Como em todas se apresentou uma elevada redução de citotoxicidade, selecionou-se as Unloaded LBG e LBG.INH.RFB 10:1:0.5 e testou-se na dose 50 µg/cm2, verificando-se um aumento da viabilidade celular, em ambas, mas maior nas partículas brancas. Reforçando também, que as doses testadas são elevadas, comparativamente com a dose fármaco/sistema administrada in vivo, onde se esperam melhores resultados de viabilidade celular. Através de citometria de fluxo, foi analisado a capacidade de os macrófagos fagocitarem micropartículas com a matriz de LBG nas linhas celulares referidas. Onde se verificou a existência de uma elevada percentagem de fagocitose nos macrófagos diferenciados a partir de THP-1 (99,5 %), e nas NR8383, uma preferência significativa por micropartículas de LBG (94,35 %) comparativamente com um polímero sem mannose na sua estrutura (53,16%). iv Após comprovada a capacidade dos macrófagos em fagocitarem micropartículas de LBG, foi avaliada a capacidade deste galactomanano em ativar macrófagos, diferenciados a partir de THP-1, e que se encontram no estado M0 de ativação, para o estado M1, com capacidade pro-inflamatória. Após a exposição destas células, á uma solução da matriz de LBG e de micropartículas de LBG.INH.RFB 10:1:0.5 na dose de 303 µg/cm2, verificou-se que, devido a sua estrutura, a LBG tem a capacidade de induzir a libertação de citocinas, factor de necrose tumoral α e interleucina 8, num nível idêntico ao lipopolissacarídeo, presente na parede bacteriana, e com num nível superior e estatisticamente significativo comparativamente com o nível basal. Estes resultados reforçam que as micropartículas obtidas a partir deste polímero, através de atomização, apresentam propriedades aerodinâmicas que permitem que atinjam a região alveolar, e sejam veículos de fármacos antituberculosos ou de um outro antibiótico. E devido a sua estrutura com mannose, permitem que haja um reconhecimento específico pelos macrófagos alveolares infetados, permitindo potenciar a sua fagocitose. Após este processo, estas micropartículas permitem a libertação dos fármacos em meio intracelular, e ainda, activarem os macrófagos, para um estado de ativação pro-inflamatório, que irá melhorar a resposta inflamatória, e consequentemente, um melhor controlo o agente infecioso. Palavras-chave: Administração pulmonar, goma de alfarroba, isoniazida, macrofagos alveolares, micropartículas, rifabutina, tuberculose. v Abstract Locust bean gum (LBG) is a polysaccharide composed of galactose and mannose residues, a composition that might be of interest in the ambit of pulmonary tuberculosis treatment. The polymer can be processed by spray-drying to produce microparticles that act as carriers for antitubercular drugs via inhalation. Once in the alveolar region, where alveolar macrophages hosting Mycobacterium tuberculosis reside, these microparticles are expected to be phagocytosed by macrophages, then releasing the drugs in the intracellular compartment where the bacteria are located. Considering that alveolar macrophages have specific surface receptors recognizing preferentially mannose residues and also with affinity for galactose units, an improved targeting of antibiotic loaded microparticles towards the bacteria hosts is expected. In this work the production of LBG microparticles by spray-drying is reported for the first time, exhibiting adequate properties for inhalation with the aim of reaching the alveolar zone (aerodynamic diameters between 1.27 and 1.90 µm). Two different first line antitubercular drugs (isoniazid and rifabutin) were effectively associated to the microparticles (association efficiencies > 82%). The cytotoxicity of the drugs, raw material and carriers (unloaded and drug-loaded) was evaluated in A549 cell line and macrophage-like cell line (macrophage differentiated THP-1 cells). It was verified that RFB has a cytotoxic effect when tested as free drug and formulations containing the drug also revealed toxicity although to a lower extension. This cytotoxic effect was more pronounced at 24h and is both time- and concentration-dependent. LBG-based carriers were also exposed to macrophage-like cells in the form of aerosol, in a dose (50 µg/cm2) that was optimized to be more close to that applied in in vivo lung administration. Although the cell viability was not as lower for RFB-containing microparticles, some cytotoxicity was still observed. Additionally, the capture of microparticles by macrophage-differentiated THP-1 cells and NR8383 cells (rat alveolar macrophages) was evaluated by flow cytometry. In both cells lines, the microparticles were insufflated over a monolayer of macrophages at dose of 50 µg/cm2, where was verified a high percentage of phagocytose (> 94 %). The capacity of microparticles to activate macrophages (differentiated THP-1 cells) was also evaluated. The exposure to a dose of 303 µg/cm2 microparticles was verified to have the ability to induce the release of cytokines (interleukin-8 and Tumor necrosis factor α), indicative of activation, at a level identical to that induced by the incubation with lipopolysaccharide. The obtained results as a whole indicate the ability of LBG to act as matrix of inhalable drug carriers produced by spray-drying. The microparticles demonstrated capacity to effectively associate model antitubercular drugs and suitable aerodynamic properties to reach the vi alveolar zone. LBG microparticles further evidenced high ability to be captured by macrophages, which is very relevant regarding tuberculosis therapy. Key-words: Alveolar macrophages, antibiotic delivery, locust bean gum, microparticles, spray-drying, tuberculosis. vii