ANA PAULA RESENDE SIMIQUELI “PRODUÇÃO CONTÍNUA DE SURFACTINA UTILIZANDO MANIPUEIRA COMO SUBSTRATO E ESTUDO DE SUA APLICAÇÃO EM CONJUNTO COM ÓLEOS ESSENCIAIS.” Campinas 2014 i ii UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS ANA PAULA RESENDE SIMIQUELI “PRODUÇÃO CONTÍNUA DE SURFACTINA UTILIZANDO MANIPUEIRA COMO SUBSTRATO E ESTUDO DE SUA APLICAÇÃO EM CONJUNTO COM ÓLEOS ESSENCIAIS.” Tese Apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciência de Alimentos. Orientadora: Profa. Dra. Glaucia Maria Pastore Co-orientadora: Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pela aluna Ana Paula Resende Simiqueli e orientada pela Profa. Dra, Glaucia Maria Pastore Assinatura da Orientadora Campinas 2014 iii Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816 Simiqueli, Ana Paula Resende, 1987- Si45p SimProdução contínua de surfactina utilizando manipueira como substrato e estudo de suas aplicações em conjunto com óleos essenciais / Ana Paula Resende Simiqueli. – Campinas, SP : [s.n.], 2014. SimOrientador: Glaucia Maria Pastore. SimCoorientador: Marta Cristina Teixeira Duarte. SimTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos. Sim1. Biossurfactantes. 2. Manipueira. 3. Fermentação. 4. Óleos essenciais. 5. Atividade antimicrobiana. I. Pastore, Glaucia Maria. II. Duarte, Marta Cristina Teixeira. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. IV. Título. Informações para Biblioteca Digital Título em outro idioma: Continuous production of surfactin using cassava wastewater as substrate and study of its applications in blends with essential oils Palavras-chave em inglês: Biosurfactants Cassava wastewater Fermentation Essential oils Antimicrobial activity Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Doutora em Ciência de Alimentos Banca examinadora: Glaucia Maria Pastore [Orientador] Ana Elizabeth Cavalcante Fai Buarque de Gusmão Cedenir Pereira de Quadros Janaína Nicanuzia dos Prazeres Hélia Harumi Sato Data de defesa: 07-11-2014 Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos iv Powered by TCPDF (www.tcpdf.org) Banca Examinadora ________________________ Profa. Dra. Glaucia Maria Pastore Orientadora ________________________ Dra. Ana Elizabeth Cavalcante Fai Buarque de Gusmão Membro Titular DTA/UNIRIO ________________________ Prof. Dr. Cedenir Pereira de Quadros Membro Titular CFARM/Univasf ________________________ Dra. Janaína Nicanuzia dos Prazeres Membro Titular IQ/USP ________________________ Profa. Dra. Hélia Harumi Sato Membro Titular DCA/FEA/UNICAMP ________________________ Dr. Francisco Fábio Cavalcante Barros Membro Suplente INPI ________________________ Prof. Dr. Mário Roberto Maróstica Júnior Membro Suplente DCA/FEA/UNICAMP ________________________ Dr. Murillo Lino Bution Membro Suplente DCA/FEA/UNICAMP v vi Agradecimentos À Profa. Glaucia Maria Pastore, pela orientação e apoio sempre; À Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte, por me receber com tanto carinho em seu laboratório e co-orientar esta tese; Aos membros da banca examinadora desta tese pela disponibilidade, auxílio nas correções e críticas; Aos colegas do Laboratório de Bioaromas: Ana Paula, Ana Flávia, Ana Stela, Angélica, Beth, Bruno, Dora, Gustavo, Henrique, Jane, Juliana, Leonardo, Maysa, Marina, Meíssa, Murillo, Nadir, Patrícia, Renata, Rosângela, Verônica e tantos outros que passaram por lá; Aos colegas do Laboratório de Microbiologia do CPQBA: Alexandre, Aline, Ângela, Brunno, Camila, Flávia, Laura, Márcio e Valéria; Em especial a Cristiano José de Andrade, Fábio Barros, Carolina Pereira, Carlos Gallo, Caroline Breda e Alessandra Gasperini, pela ajuda no desenvolvimento deste trabalho; Ao Giovane pela amizade, compreensão e por compartilhar o sonho comigo; À minha família, pais Sebastião e Carmen, e irmãos, Roberto e Felipe, pelo incentivo, apoio e por serem sempre a minha base. vii viii Sumário Lista de Ilustrações ........................................................................................................... xi Resumo ........................................................................................................................... xvii Abstract ............................................................................................................................ xix 1. Introdução .................................................................................................................... 1 2. Revisão Bibliográfica .................................................................................................. 3 2.1. Biossurfactantes ................................................................................................... 3 2.1.1. Surfactina ............................................................................................................. 6 2.1.2. Substratos alternativos para a produção de biossurfactantes ............................. 7 2.1.3. Produção contínua de biossurfactantes por B. subtilis ........................................ 8 2.2. Produção de amilases e proteases por Bacillus subtilis .................................. 9 2.3. Óleos essenciais ................................................................................................. 10 2.3.1. Aloysia gratissima .............................................................................................. 12 2.3.2. Cinnamomum burmannii .................................................................................... 14 2.3.3. Gênero Cymbopogon ........................................................................................ 14 2.3.4. Cyperus articulatus ............................................................................................ 15 2.3.5. Eugenia caryophyllata ....................................................................................... 16 2.3.6. Lippia sidoides ................................................................................................... 16 2.3.7. Origanum vulgare .............................................................................................. 17 2.3.8. Piper abutiloides ................................................................................................ 18 2.4. Atividade antimicrobiana da surfactina e óleos essenciais ........................... 18 2.4.1. Alimentos e área médica ................................................................................... 19 2.4.2. Agricultura .......................................................................................................... 22 2.4.3. Potencial da utilização de emulsões .................................................................. 24 3. Objetivos .................................................................................................................... 26 3.1. Objetivos gerais .................................................................................................. 26 3.2. Objetivos específicos ......................................................................................... 26 4. Material e Métodos .................................................................................................... 27 4.1. Micro-organismo e manutenção da cultura ..................................................... 27 4.2. Produção e purificação de biosurfactantes ..................................................... 27 4.2.1. Coleta, transporte e armazenamento da manipueira ........................................ 27 4.2.2. Produção de biossurfactante por B. subtilis ...................................................... 27 a) Início da Fermentação ............................................................................................. 27 b) Alimentação ............................................................................................................. 28 4.2.3. Acompanhamento do processo ......................................................................... 28 4.2.4. Purificação do biossurfactante ........................................................................... 29 a) Precipitação ácida ................................................................................................... 29 b) Extração por solventes ............................................................................................ 29 4.2.5. Caracterização do biossurfactante de B. Subtilis LB5a ..................................... 30 a) Estudos de estabilidade do biossurfactante ............................................................ 30 b) Índice de emulsão (IE) ............................................................................................. 30 4.2.6. Atividade enzimática .......................................................................................... 31 a) Atividade proteolítica ............................................................................................... 31 b) Atividade amilolítica ................................................................................................. 31 4.3. Extração de óleos essenciais e identificação dos compostos voláteis ........ 32 4.4. Atividade antibacteriana .................................................................................... 34 4.4.1. Preparo das amostras para ensaios com linhagens de bactérias ..................... 34 ix 4.4.2. Linhagens de bactérias utilizadas ...................................................................... 35 4.4.3. Preparo do Inóculo ............................................................................................ 35 4.4.4. Determinação da atividade antibacteriana pelo método da microdiluição ......... 35 4.4.5. Determinação da concentração bactericida mínima (CBM) .............................. 36 4.4.6. Inibição da adesão do biofilme .......................................................................... 36 4.5. Atividade antifúngica ......................................................................................... 37 4.5.1. Preparo das amostras para ensaios com linhagens de fungos filamentosos .... 37 4.5.2. Linhagens de fungos filamentosos utilizadas .................................................... 38 4.5.3. Preparo do Inóculo ............................................................................................ 39 4.5.4. Determinação da atividade antifúngica pelo método da microdiluição .............. 39 4.5.5. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) ................................. 39 4.5.6. Determinação da cinética de crescimento ......................................................... 40 4.6. Potencial para inibição de micro-organismos orais ....................................... 40 4.6.1. Preparo das amostras para ensaios com micro-organismos orais .................... 40 4.6.2. Linhagens de micro-organismos orais utilizadas ............................................... 41 4.6.3. Preparo do inóculo ............................................................................................. 41 4.6.4. Concentração inibitória mínima (CIM) ............................................................... 42 5. Resultados e Discussão ........................................................................................... 43 5.1. Fermentação contínua ....................................................................................... 43 5.1.1. Cinética da produção de biossurfactante por Bacillus subtilis ........................... 43 5.1.2. Estabilidade do Biossurfactante produzido ........................................................ 50 a) Estudos de Estabilidade .......................................................................................... 50 b) Índice de emulsão ................................................................................................... 51 5.1.3. Coprodução de enzimas .................................................................................... 52 5.2. Identificação dos compostos voláteis presentes nos óleos essenciais estudados ...................................................................................................................... 56 5.3. Estudos de aplicação ......................................................................................... 61 5.3.1. Bactérias ............................................................................................................ 61 a) Atividade antimicrobiana ......................................................................................... 61 b) Inibição de biofilme .................................................................................................. 71 5.3.2. Fungos Fitopatógenos ....................................................................................... 76 5.3.3. Micro-organismos orais ..................................................................................... 98 6. Conclusões .............................................................................................................. 101 7. Referências Bibliográficas ..................................................................................... 104 x