动 物 学 研 究 2011，Feb. 32(1): 31−39 CN 53-1040/Q ISSN 0254-5853 Zoological Research DOI：10.3724/SP.J.1141.2011.01031 正常猕猴与树鼩神经系统和免疫系统组织中 大麻素与阿片受体的表达 张庆余1, 2, 范晓娜1, 曹 毅1,* (1. 中国科学院和云南省动物模型与人类疾病机理重点实验室, 中国科学院昆明动物研究所, 云南 昆明 650223; 2. 中国科学院研究生院, 北京 100049) 摘要：为应用猕猴和树鼩动物模型研究毒品成瘾对神经/免疫系统的影响提供基础数据，对大麻素及阿片受体 在正常猕猴和树鼩神经系统和免疫系统的表达进行初步确定。采集正常猕猴和树鼩新鲜组织(皮质、小脑、脑干、 海马、脊髓、脾脏), 应用半定量逆转录PCR和实时定量PCR的方法检测大麻素与阿片受体mRNA在猕猴和树鼩 各组织中的表达情况。猕猴脑部各区包括脾脏均表达大麻素受体1 (CNR1), 而大麻素受体2 (CNR2)只表达于脾脏 内。三类阿片受体中, mu(µ)受体表达最为广泛, 在以上各组织中均有表达; delta (δ) 受体表达的组织最少, 只在海 马表达; kappa (κ) 受体表达介于两者之间, 分别在皮质、小脑、脑干、脊髓中表达。在树鼩组织中, CNR1和CNR2 表达于整个大脑重要脑区中, 且 CNR1 表达量高于同一区域内 CNR2 表达的量; 脾脏中 CNR2 的表达较高, 而 CNR1 不表达。三类阿片受体只有检测到μ受体在脑部与脾脏表达, 且在各个脑区的表达量明显高于脾脏的表达 量; δ 受体和 κ 受体在被检各个组织中均无表达。总体而言, 两种大麻素受体在猕猴和树鼩体内表达情况与人类 和鼠的情况类似, 而三类阿片受体在猕猴体内表达情况与人类更为接近。猕猴和树鼩可能可用于人类毒品成瘾的 研究; 猕猴在某些神经受体的表达更接近人类, 其在研究毒品成瘾的机理和对免疫系统的影响方面仍有不可替代的 地位。 关键词：猕猴; 树鼩; 大麻素受体; 阿片受体; mRNA表达; 神经系统; 免疫系统 中图分类号：Q959.832; Q959.842; R338.2; R971.3 文献标志码：A 文章编号：0254-5853-(2011)01-0031-09 Expression of cannabinoid and opioid receptors in nervous as well as immune systems of Macaca mulatta and Tupaia belangeri ZHANG Qing-Yu 1,2, FAN Xiao-Na1, CAO Yi 1,* (1. Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms of the Chinese Academy of Sciences & Yunnan Province, Kunming Institute of Zoology, Kunming Yunnan 650223, China; 2. Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China) Abstract: To make Macaca mulatta and Tupaia belangeri as experimental animals for studying functions of opioid and cannabinoid receptors in drug addiction, we examined expression of the opioid and cannabinoid receptors in nervous and immune system of the two animals. We dissected normal adult M. mulatta and T. belangeri, collected tissues of cortex, cerebellum, brain stem, hippocampus, spinal cord, and spleen, and then applied the semi-quantitative PCR and real-time quantitative PCR methods to investigate the mRNA expression levels of the opioid and cannabinoid receptors in these tissues. In M. mulatta, the cannabinoid receptor 1 (CNR1) mRNA was expressed in the all tissues; in contrast, the cannabinoid receptor 2 (CNR2) mRNA was only present in the spleen. The mu opioid receptor (MOPR) was detected in all tissues, and the kappa opioid receptor (KOPR) was found in the cortex, cerebellum, brain stem, and spinal cord, but not in hippocampus and spleen. However, the delta opioid receptor (DOPR) was restrictively expressed in the hippocampus. In T. belangeri, CNR1 and CNR2 were expressed in the five regions of the brain. CNR2, but no CNR1, was also detected in the spleen. MOPR was expressed in all examined tissues, and its expression levels in the brain were higher than that in the spleen. DOPR and KOPR were not found in all tissues. Taken together, the expression profiles of cannabinoid receptors in human being, M. mulatta, T. belangeri, and rat were similar, and the expression patterns of the 收稿日期：2010-12-06; 接受日期：2011-01-19 基金项目：中国科学院基础前沿研究专项项目（KSCX2-EW-J-23）；中国科学院和云南省动物模型与人类疾病机理重点实验室资助项目 ∗通讯作者(Corresponding author), E-mail: [email protected] 第一作者简介：张庆余, 男, 硕士研究生, 研究方向：毒品成瘾机理, E-mail:[email protected] 32 动 物 学 研 究 32卷 opioid receptors in M. mulatta were more close to human beings. The opioid and cannabinoid receptors were expressed in the tissues of nervous and immune systems of M. mulatta and T. belangeri, and both animals could be used for studying drug addiction. Macaca mulatta is still the best experimental animal for drug addiction research because it shows very similar expression profiles of these receptors to human beings. Key words: Macaca mulatta; Tupaia belangeri; Cannabinoid receptor; Opioid receptor; mRNA expression; Nervous system; Immune system 对于研究人类神经−精神疾病, 非人灵长类动 各种亚型的分布各不相同。尽管三种受体在人体分 物模型具有独特优势和不可替代的作用。猕猴作为 布不同, 结合各类配体亦有其特异性, 但三类受体 最常用的非人灵长类实验动物, 已广泛应用于人类 均为 G 蛋白偶联受体, 主要分布于神经元细胞, 调 神经−精神疾病的研究, 如毒品成瘾、抑郁症等。树 节神经网络的功能。亦有报导阿片受体分布于免疫 鼩是进化上特殊的物种, 其神经系统结构与灵长类 系统的细胞 (Bidlack et al, 2006; Sharp, 2006), 参与 较为接近 (Sofroniew et al, 1981; Jiao et al, 2010), 细胞因子产生、免疫调节、细胞增殖、细胞凋亡等 已有树鼩作为实验动物应用于神经系统研究的报道 病理生理过程。 (Fuchs, 2005; Pawlik et al, 1999; Podlisny et al, 研究大麻素受体和阿片受体在猕猴和树鼩脑 1991)。然而, 在分子水平系统研究毒品成瘾相关的 区及脾脏的分布情况, 是将两者应用为毒品成瘾动 大麻素受体与阿片受体在猕猴和树鼩的表达, 尚未 物模型, 研究毒品成瘾机制、毒品成瘾过程免疫系 见报道。 统功能紊乱的前期工作, 具有实际意义。本实验以 毒品成瘾(drug addiction)与各个脑区, 尤其是 猕猴和树鼩为实验对象, 采用逆转录PCR(RT-PCR) 与学习记忆相关的结构, 如大脑前皮质区(PFC)、海 的方法, 检测大麻素受体和阿片受体在它们脑区及 马(HIP)、腹侧被盖区(VTA)、伏隔核(NAc)密切相 脾脏组织的表达, 为猕猴和树鼩作为神经/免疫系 关(Volkow et al, 2002; Bruijnzeel, 2009; Peters et al, 统疾病研究的动物模型提供基础数据。 2009)。一般认为, 毒品成瘾过程中, 毒品中的致瘾 1 材料与方法 成分与神经系统分布的各类受体(阿片受体、大麻素 受体)结合(Maldonado, 2010; López-Moreno et al, 1.1 仪器与试剂 2010; Robledo, 2010), 从而改变神经元兴奋性, 最 冷冻离心机, Bio-Rad Mycycler PCR 仪, ABI 终导致神经可塑性改变, 改变整个神经网络的功能, stepone plus 实时定量 PCR 仪, 百泰克 Highpure 引起毒品躯体依赖, 甚至出现心理依赖。其中大麻 RNAse-free 总RNA提取试剂盒, pormega反转录试 素受体在参与毒品成瘾过程担当了重要的角色 剂盒, RNase free PCR管, sigma jumpstart taq 酶, (López -Moreno et al, 2010; Robledo, 2010)。至今已 SYBR greenⅠ, DNTP。 经发现大麻素受体有两种类型, 大麻素受体 1 1.2 实验动物 (CNR1)和大麻素受体 2 (CNR2)。两种大麻素受体 2只正常成年猕猴, 年龄分别是11岁和3.5岁, 都为七次跨膜的 G 蛋白偶联受体, 人的 CNR1 和 体重分别为41.5 kg和35 kg。正常喂养成年树鼩5 CNR2 氨基酸序列有 44%的同源性, 在跨膜区氨基 只, 体重120～160 g。实验动物实验前未给过任何 酸序列同源性达到68 % (Jean et al, 2010)。CNR1主 药物。实验动物由中国科学院昆明动物研究所实验 要分布于神经系统神经元上, 其余在生殖系统与消 动物中心提供[SCXK (滇) 2008-0001], 所有动物均 化系统也有低的表达; CNR2 主要分布于免疫系统 按照动物饲养要求及动物福利进行饲养。 各类细胞膜表面, 是免疫系统特异的大麻素受体, 1.3 实验方法 另外在胶质细胞也有表达, 参与脑部炎症反应的调 1.3.1 解剖取材 节(Jean et al, 2010; Martykánová, 2010)。阿片受体作 在动物进食前, 空腹注射 3%戌巴比妥钠(1.2 为阿片类物质作用的经典靶位, 参与阿片类物质成 mL/kg), 麻醉后处死。取出脑组织, 分别采取大脑 瘾的过程。阿片受体共有三类：mu(µ)受体、delta (δ) 皮质、小脑、海马、中脑、脊髓。脾脏组织也被采 受体和 kappa (κ)受体。三类阿片受体下有各种亚型, 取。所有新鲜组织装入1.5 mL RNase-free 的管子, 1期 张庆余等：正常猕猴与树鼩神经系统和免疫系统组织中大麻素与阿片受体的表达 33 冻存于液氮中备用。 保温 1 h 以上, 使 RNA 逆转, 得到的 cDNA 用做 1.3.2 反转录 PCR模板。 将冻存于液氮中的组织取出, 放入预冷的研钵 1.3.3 引物设计挑选 中, 捣成块, 取大约50 mg样品, 其余装回管子。加 由于树鼩基因组测序没有完成, 现在 GeneBank 液氮到研钵中将组织研磨成粉后, 加 1 mL 裂解液 尚无法获得各种基因的 cDNA 序列。因此, 通过对 (百泰克总 RNA 提取试剂盒), 边裂解边研磨, 充分 比人、猕猴、大鼠、小鼠大麻素受体mRNA序列找 研磨后将匀浆收集装入RNase-free 1.5 mL管子, 静 出保守区域, 确定引物位置, 设置通用引物来对相 置 5 min。以后步骤严格按照试剂盒说明书进行操 应的受体进行扩增。设计好并合成的引物通过PCR 作。收集到的RNA进行RNA定量及电泳检测其质 检测, 选择扩增效率高、特异性好的引物来检测各 量。取2～3 µg RNA逆转成cDNA。50 µL逆转体 组织中相应受体mRNA的表达。两种大麻素受体和 系包括: 5 µL 100 µmol/L的 6碱基随机引物、2 µL 三种阿片受体的通用引物设计过程与大麻素受体 逆转录酶(promega 公司)、2.5 µLDNTP mixture(10 通用引物设计过程一样。各受体PCR通用引物序列 mmol/L, 上海生工)、 0.7 µLRNA酶抑制剂 (takara 见表1。 公司)、无RNA酶水(RNase-free H 0) 4.8 µL。37℃ 2 表1 实验中所用的引物序列 Tab. 1 The primers used in the study 受体Receptors 正向序列Forward primer 反向序列Reversed primer 产物长度Products length (bp) CNR1 5'AGTATGCTCTGCCTGCTGAA3' 5'GAGTCCCCCATGCTGTTATC3' 140 CNR2 5'CCCGTGGGAGGGCACTGGT3' 5'GGCACCTGCCTGTCCTGGT3' 259 MOPR 5'TCTTCGGAAACTTCCTGGTCA3' 5'TGCAGAGGGTGAATATGCTGG3' 230 DOPR 5'GCCACCAGCACGCTGCCT3' 5'GTTGATCAGCTTGGCCTTGG3' 217 KOPR 5'CCTGGCTTTGGCAGATGCTT3' 5'CATGTTGTAGTAATCAATGGAA3' 127 β-actin 5'GCCCTGAGGCTCTCTTCCA3' 5'CGGATGTCCACGTCACACTT3' 100 CNR1：大麻素受体1 (cannabinoid receptor 1); CNR2：大麻素受体2 (cannabinoid receptor 2); MOPR：µ型阿片受体 (mu opioid receptor); DOPR：δ型阿 片受体 (delta opioid receptor); KOPR：κ型阿片受体 (kappa opioid receptor)。 1.3.4 半定量PCR 2.5 µL缓冲液、0.5 µLDNTP mixture (10 mmol/L 上 25 µL的PCR反应体系里包括：19.6 µL双蒸水、 海生工)、上下游引物各0.5 µL、0.4 µL jumpstart taq 2.5 µL缓冲液、0.5 µL DNTP mixture(10 mmol/L 上 酶 (sigma公司)、0.5 µL 10xSYBR green Ⅰ、1 µL 海生工)、上下游引物各0.5 µL、0.4 µL jumpstart taq 逆转好的cDNA 作模板。同时, 设置阴性对照以确 酶 (sigma公司)、1 µL逆转好的cDNA 作模板。同 定PCR过程中的本底荧光。每种引物每个样本做重 时, 设置阳性对照和阴性对照。各受体扩增条件为： 复三管。采用∆∆ct相对定量的方法, 以β-actin作为 95℃预热变性1min; 95℃变性30 s, 60℃退火30 s, 内参, 校正目的基因表达, 获得目的基因在不同组 70℃ 10 s, 共20个循环; 95℃变性15 s, 55℃ 退火 织间的相对表达量。 30 s, 70℃ 延伸10 s, 根据不同受体的丰度选择不 2 结 果 同的扩增循环数(18±2); 70℃后延伸5 min。β-actin 内参扩增条件为：95℃预热变性1 min; 95℃变性30 2.1 Total RNA提取与质量检测 s, 60℃退火30 s, 70℃ 10 s, 共20个循环; 70℃后延 分别抽提猕猴、树鼩脑区大脑皮质, 小脑、中 伸5 min。PCR扩增完成后取产物5～8 µL, 在含有 脑、海马、脊髓样品, 抽提的RNA测定其浓度, 按 溴化乙锭(EB)的2%琼脂糖胶中, 120伏电压电泳30 每孔200 ng进行琼脂糖电泳。电泳后, 扫胶结果见 min, 凝胶成像仪检测。 图1, 18S 核糖体RNA和28S核糖体RNA条带相 1.3.5 实时定量PCR 对完整, 没有迷散, 两者之间的比值接近 1/2,说明 实时定量 PCR 所用模板和引物与半定量 PCR RNA的质量较好。 相同。实时定量PCR反应体系为：19.1 µL双蒸水、 2.2 猕猴组织大麻素受体与阿片受体mRNA的表达 34 动 物 学 研 究 32卷 猕猴体内, 大麻素受体1 (CNR1)在脾脏及其余 到99%时, 与人和猕猴的序列相似度分别到达94% 脑区内都表达, 而大麻素受体2 (CNR2)只在脾脏内 和93%, 而与大鼠和小鼠的相似度分别达到91%和 有表达(图2b,c)。阿片受体, µ受体在各个脑区和脾 88%, 同时亦未发现其他任何基因比对上。这表明 脏表达(图2d); κ受体在皮质、小脑、脑干、脊髓中 表达, 在海马与脾脏中不表达见图2(f); 与 κ 受体 图1 检查RNA的质量 Fig. 1 Quality control of the total RNA extracted 图为2% 琼脂糖胶total RNA 电泳图, 点样孔所上样品来源依次是1： 皮质; 2：小脑; 3：脑干; 4：海马; 5： 脊髓; 6：脾脏; 7：脾脏; 8 marker(D2000)。 The total RNA were separated by gel electrophoresis in 2% agarose. 1: cortex; 2: cerebellum; 3: brain stem; 4: hippocampus; 5: spinal cord; 6: spleen; 7: spleen; 8: marker (D2000). 不同, δ受体在海马有表达, 其余各处未检测到表达 (图 2e)。实时定量 PCR 结果与半定量 PCR 结果一 致 (图2g)。 2.3 树鼩组织大麻素受体与阿片受体mRNA的表达 同样以通用引物扩增树鼩组织来源的 cDNA, 两种大麻素和µ型阿片受体引物有扩增产物, 且扩 增长度与猕猴组织 cDNA 扩增得到的产物长度一 致。为了进一步确定所得的 PCR 产物是目的基因, 对PCR产物进行测序, 测序结果如表2。测序结果 与 GenBank 中的转录本进行 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 比对, CNR1 BLAST比对, 图2 猕猴大麻素和阿片受体mRNA组织间相对表达情况 Fig. 2 Relative expression of cannabinoid and opioid 选取测序可信区域89 nt用BLAST工具进行序列比 receptors mRNA in the tissues of Macaca mulatta 对, 发现质询范围达到的 88%时, 该序列与小鼠和 1：皮质; 2：小脑; 3：脑干; 4：海马; 5：脊髓; 6：脾脏; 7：阴性对照(水); 大鼠序列相似度到达 98%, 质询范围达到 91%时, 8：marker (D20000)。a：β-actin (100 bp), 内参表达; b：大麻素受体1 (CNR1, 140 bp); c：大麻素受体 2 (CNR2, 259 bp); d：µ型阿片受体 与人和猴的序列相似度也达到95%。与其他物种的 (MOPR, 230 bp); e：δ型阿片受体 (DOPR, 217 bp); f：κ 型阿片受体表达 大麻素受体 1 的序列相似度也较高, 最低相似度是 (KOPR, 127 bp; g：实时定量PCR结果。 采用∆∆Ct相对定量的方法, 将 92%(更格卢鼠属), 同时没有发现除大麻素受体 1 脾脏中CNR1、MOPR、DOPR受体表达量设定为1, 小脑中CNR2、KOPR 受体表达量设定为1。柱形图显示各受体在猕猴6种组织中的分布情况和 的其他基因比对上; CNR2 BLAST比对, 选取测序 相对表达量。 可信区域236 nt比对, 质询范围达到97%时, 与人 1: cortex; 2: cerebellum; 3: brain stem; 4: hippocampus; 5: spinal cord; 6: 的相似度达到 96%, 而质询范围达为 97%时, 与猕 spleen; 7: negative control (H2O); 8: DNA marker (D2000). a: β-actin (100 bp); b:CNR1 (140 bp); c: CNR2 (259 bp); d: MOPR (230 bp); e:DOPR (217 猴的相似度达到了 93%, 质询范围为到 94%, 与小 bp) ; f: KOPR (127 bp); g: The results of the real-time quantitative PCR analysis, The expression of CNR1, MOPR, DOPR in spleen was set to 1 and 鼠的相似度达到 82%, 同时未发现有其他基因比对 the expression of CNR2 and KOPR in cerebellum was set as 1 as well, The 上; MOPR BLAST 比对结果, 选取测序可信区域 picture showed the relative expressions of each receptor in the six tissues of 175 nt, 用BLAST工具进行序列比对, 质询范围达 Macaca mulatta. 1期 张庆余等：正常猕猴与树鼩神经系统和免疫系统组织中大麻素与阿片受体的表达 35 表2 树鼩三类受体PCR产物测序结果 Tab. 2 The PCR products sequencing results of three receptors of Tupaia belangeri PCR产物测序结果PCR products sequencing results (5'—>3') GCCCCTTACCGATCTCTATACTCTGAGGAGCAGGACCTGAGACATGC 大麻素受体1 (CNR1) TTTCCGGAGCATGTTCCCCTCGTGTGAAGGCACTGCGCAACCTCTGG ATAACAGCATGGGGGACTCA GTTCAGCTACTGACAAGCGTGACTATGACCTTCACAAGCCTCTGTAGGT AGGCTCCTGCTGAACGCCATTGACCGATACCTCTGCCTGCGCTATCCAC 大麻素受体2 (CNR2) CTTCCTACAAAGCTCTGCTCACCCGTGGAAGGGCACTGGTCACCCTGG GCATCATGTGGGTCCTCTCAGCACTAGTGTCCTACCTGCCCTCATGGGA TAGACTTGCTGTCCCAGGCCCTGCTCTGAGCTTTTCCCACTGATCCACAA CGCGTTAACGTATCGATGGAGATCACGATCTTGCAAGGATGGTTCCAAA CGGCCACGTTCCCATTAGGTAATTGACACTCTGGAAGGGCAGGGTACTT μ型阿片受体 (MOPR) GTTGCTAAAGCGTCTGCCAGGGCAAGGTTGAAAATGTAGATGTTGGTGG CAGTCTTCATTTTGGTGTATCTGACAATCACGTACATGACCAGGAAGTTT CCGAAGAA 表3 各受体mRNA在猕猴与树鼩神经系统和免疫系统主要组织表达情况 Tab. 3 Expression profiles of the receptors at mRNA level in the nervous and immune systems of Macaca mulatta and Tupaia belangeri 物种和组织Species and tissues 大麻素受体Cannabinoid receptors 阿片受体Opioid receptors CNR1 CNR2 MOPR DOPR KOPR 猕猴 Macaca mulatta 皮质Cortex +++ − + − + 小脑Cerebellum ++ − + − + 脑干Brain stem ++ − ++ − + 海马Hip ++ − + ++ − 脊髓Spinal cord + − +++ − + 脾脏Spleen + ++ + − − 树鼩Tupaia belangeri 皮质Cortex + ++ ++ − − 小脑Cerebellum + + +++ − − 脑干Brain stem + + + − − 海马Hip + + + − − 脊髓Spinal cord +++ + + − − 脾脏Spleen − + + − − +：mRNA表达 (Positive mRNA expression); −：mRNA不表达 (Negative mRNA expression)。 三种扩增产物序列与目的基因的同源基因序列是 社会健康问题。毒品成瘾涉及多个神经受体, 如大 高度相同的图3 (a,b,c)。因此, 认为通用引物扩增得 麻素受体与阿片受体等。毒品成瘾可导致严重神经 到的PCR产物就是来源于对目的基因的扩增。通过 −精神严重异常, 也影响机体免疫功能。研究神经系 PCR 检测树鼩组织中三类受体表达, 发现 统和免疫系统组织中毒品成瘾相关受体的表达和 大麻素受体1 (CNR1)除在脾脏外, 其余脑区都表达; 分布, 对阐明毒品的神经−精神损伤及免疫异常机 大麻素受体2 (CNR2)在各个脑区, 包括脾脏均有表 理有实际意义。逆转录PCR(RT-PCR)是研究mRNA 达 (图 4b,c); 而阿片受体, 仅检测到µ受体的在各 表达的常用方法, 其敏感性和特异性都较高。本课 个脑和脾脏表达, 其余二类阿片受体无检测到表达 题应用半定量和定量 RT-PCR 方法, 研究猕猴与树 (图4d, e, f,)。实时定量PCR结果与半定量PCR结 鼩神经系统和免疫系统组织中大麻素受体与阿片 果基本一致(图4g)。 受体的表达情况。脾脏含有各型免疫细胞, 在免疫 器官中最具代表性, 且取材容易。在本研究中我们 3 讨 论 用脾脏作为免疫系统的代表。我们的结果表明：猕 人类神经−精神疾病, 如毒品成瘾, 是严重的 猴体内大麻素受体1 (CNR1) mRNA在各个脑区和 a 36 动 物 学 研 究 32卷 b c 图3 树鼩大麻素受体1、大麻素受体2及µ型阿片受体PCR产物测序得到的序列, 与GeneBank 中的所有已有物种的全部转录本通过BLAST进行序列比对的结果 Fig. 3 Comparison of the CNR1, CNR2 and MOPR sequences obtained from the tissues of Tupaia belangeri with the GeneBank transcription database using the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) a: CNR1 BLAST比对结果; b: CNR2 BLAST比对结果; c: MOPR BLAST比对结果(由于截图区域有限, 少部分物种比对结果未显示)。 a: the comparative results of CNR1; b: the comparative results of CNR2; c: the comparative results of MOPR. 1期 张庆余等：正常猕猴与树鼩神经系统和免疫系统组织中大麻素与阿片受体的表达 37 稍有不同, 而大麻素受体 2 在树鼩各个组织中均有 表达, 与猕猴相比差别较大。阿片受体mRNA在树 鼩体内表达模式相对简单, 只检测到有 mu 型阿片 受体(MOPR)mRNA 表达, δ型和κ型两种阿片受体 在各个组织没有检测到表达。相比于树鼩, 猕猴体 内阿片受体表达情况较为复杂, µ型阿片受体 (MOPR)与树鼩表达情况一样, 在这几个组织中均 表达, 而δ型阿片受体(DOPR)只在海马表达, κ型受 体(KOPR) mRNA在皮质、小脑、脑干和脊髓处表 达。除了表达外, 同一受体在不同的组织中表达量也 不尽相同, 如大麻素受体1在猴各脑区中表达丰度, 高于脊髓与脾脏; µ型阿片受体(MOPR)mRNA在猕 猴的脊髓表达最高, 其次是脑干、海马、小脑、皮 质, 表达最低的是脾脏。同一受体的mRNA在不同 的物种表达模式也有区别, 例如大麻素受体 2 在树 鼩的 6 类组织中均有表达, 但在猴的组织当中仅有 外周的脾脏表达。再有κ型阿片受体(KOPR)mRNA 在猕猴的皮质、小脑、脑干、脊髓有表达, 但是在 树鼩体内这四种器官当中均没有检测到表达。这些 结果说明各类受体表达方式是很复杂的, 这可能跟 物种生存环境, 遗传进化因素等有关。 由于进化地位高低, 物种之间同一受体表达谱 各异。人的大麻素受体 1 在脑在广泛表达, 主要在 于突触前神经元上, 调节神经元的兴奋性; 在脊神 经元, 同样有大麻受体 1 的分布, 参与感觉传递; 图4 树鼩大麻素受体与阿片受体mRNA组织间相对 表达情况 免疫系统组织尚未发现有其分布。人大麻素受体 2 Fig. 4 Relative expression of the cannbinoid receptors and opioid 主要分布于免疫系统组织、细胞当中, 参与免疫调 receptors mRNA in the tissues of Tupaia belangeri 节、炎症反应等生理病理过程; 正常状态下, 脑和 1：皮质; 2：小脑; 3：脑干; 4：海马; 5：脊髓; 6：脾脏; 7：阳性对照(基 因组DNA或猕猴cDNA); 8：阴性对照(水); 9: marker(D20000)。a：内 脊髓中分布较少, 主要存在于胶质细胞中; 病理过 参β-actin (100 bp); b：大麻素受体1(NCR1, 140 bp); c：大麻素受体 程时(炎症反应), 含量会增加 (Onaivi et al, 2006; 2(NCR2, 259 bp); d：µ型阿片受体(MOPR, 230 bp); e：δ 型阿片受体 (DOPR, 217 bp); f：κ 型阿片受体表达(KOPR, 127 bp); g：实时定量PCR Emmanuel, 2006)。三种阿片受体在人脑与脊髓中都 结果. 采用∆∆Ct相对定量的方法, 将脾脏中CNR2和MOPR表达量设 有表达, 在免疫系统组织、细胞中亦有分布(Perry et 定为1, 将小脑中CNR1表达量设定为1. 柱形图显示受体在树鼩6种组 al, 2004; Sharp, 2006)。鼠的大麻素受体1主要分布 织中的分布情况和相对表达量。 mRNA in the tissues of Tupaia belangeri tissues. 1: cortex; 2: cerebellum; 3: 于脑区和脊髓的神经元突触上, 我们实验发现脾脏 brain stem; 4: hippocampus; 5: spinal cord; 6: spleen; 7: positive control 中也有较低的大麻素受体 1 的表达; 大麻素受体 2 (treeshrew genomic DNA or macaca cDNA); 8: negative control(H2O); 9: marker(D2000). a: β-actin(100 bp); b: CNR1(140 bp); c: CNR2 (259 bp); d: 作为免疫系统的特有的大麻素受体类型, 广泛存在 MOPR(230bp); e：DOPR (217bp); f: KOPR (127 bp); g: The results of the 于鼠免疫相关的细胞当中, 现在研究也发现功能性 quantitative real-time PCR analysis. The expressions of CNR2 and MOPR 的大麻素受体2也分布在鼠的很多脑区(大脑皮质、 in spleen were set to 1 and the expression of CNR1 was set to 1 as well. The picture showed the relative expression levels of each receptor in the six 胼胝体、海马、基底核区及小脑浦肯野细胞层、脑 tissues of T. belangeri. 桥), 参与了某些生理病理过程。三种阿片受体的在 脾脏都有表达, 而大麻素受体2 (CNR2) mRNA仅 鼠体内表达相对而言都较为丰富, 正常情况下都存 检测到在外周的脾脏表达; 在树鼩体内大麻素受体 在于脑区、脊髓、免疫细胞当中 (Bagnoli et al, 2003; 1 除在脾脏外, 在各个脑区也均有表达, 这与猕猴 Wu et al, 2009), 机体应激状态下表达会随之发生改 38 动 物 学 研 究 32卷 变, 协调机体对外界环境的适应(Sharp, 2006)。 序列可能会与通用引物存在不匹配的情况, 从而导 总体看来, 猕猴体内无论是大麻素受体还是阿 致PCR检测失败, 所以对于这两类受体的表达仍要 片受体表达模式均与人更为接近。树鼩体内大麻受 进一步确定。我们还明确指出, mRNA 的表达情况 体表达模式与人基本相同, 而三类 (µ、κ、δ)阿片 只是从一个方面反映其对应的基因的表达情况, 有 受体, 只检测到 µ 型受体的表达, 其他两种阿片受 时 mRNA 表达量并不一定真实反应基因编码的蛋 体在任何组织中均未检测到有其mRNA表达, 这与 白质的含量, 更不能反映其蛋白定位。另外, 对大 人相差较大。这可能意味着树鼩的阿片受体的表达 麻素与阿片受体在免疫系统中表达情况, 我们只检 与大麻素表达相比, 更有选择性。在进化地位上, 测了有代表性, 且取材相对容易的脾脏, 而对其他 大麻素受体可能更为保守, 参与基本的神经活动 免疫器官如胸腺、骨髓, 对特定免疫细胞, 如 T 淋 (奖赏效应、痛觉传递、恐惧记忆), 而阿片受体可能 巴细胞、B 淋巴细胞、树突状细胞、K 细胞、NK 与与灵长类高级认知功能 (学习记忆、认知创造、 细胞等的表达此研究尚未涉及, 这将限制神经免疫 复杂情绪等)关系更为密切。与树鼩相比, 猕猴大麻 学的研究。因此, 下一步将通过Rapid Amplification 素受体与阿片受体表达与人较为接近, 这反映了猕 of cDNA End (RACE) 等方法获取受体基因的 猴的进化地位更高, 受体表达模式与人更为相似; cDNA 全长、克隆、蛋白体外表达, 最终获得有活 但也应当看猕猴体内大麻素受体2仅表达于脾脏。 性的蛋白, 制备相应抗体, 进而对这几种重要的受 这与人不同, 人脑区有大麻素受体 2 的表达, 这提 体在神经系统/免疫系统各类组织, 包括具体不同 示我们大麻素受体2在进化过程中最初的组织起源 类型细胞在 mRNA 和蛋白质两种水平上进行深入 可能是免疫系统组织, 随着进化过程的发展逐渐表 研究, 以期全面认识猕猴和树鼩, 更好地开发利用 达于神经系统, 连结神经免疫两大系统, 并在神经 这些动物资源用于人类疾病的研究。 免疫的过程中发挥作用。 本实验由于通用引物设计过程中引物对的选 致谢：感谢中国科学院昆明动物研究所动物中 择余地不足, 所用的通用引物没有检测到 δ 型和κ 心提供的实验用猕猴和树鼩。感谢昆明动物研究所 型两种阿片受体在树鼩各个组织的表达。尽管通用 分子病理实验室全体工作人员及部分研究生在动 引物可以扩增包括人、猕猴、大鼠、小鼠等多种物 物解剖方提供的帮助。感谢后期审稿人的辛勤劳动 种的 cDNA, 但是仍不能排除在树鼩体内两类受体 和提供的修改意见。 参考文献： Bagnoli P, Dal Monte M, Casini G. 2003. 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