PPGI m UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA EVELIN SANTOS OLIVEIRA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Potenciais marcadores de proteção para avaliação de estratégias vacinais contra Tuberculose. SALVADOR - BAHIA 2008 1 PPGI m UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA EVELIN SANTOS OLIVEIRA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Potenciais marcadores de proteção para avaliação de estratégias vacinais contra Tuberculose. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Imunologia como requisito para obtenção do título de mestre em Imunologia. Orientadora: Theolis Barbosa Co-orientador: Sérgio Arruda SALVADOR – BAHIA 2008 2 EVELIN SANTOS OLIVEIRA POTENCIAIS MARCADORES DE PROTEÇÃO PARA ESTRATÉGIAS VACINAIS CONTRA TUBERCULOSE. Esta dissertação de mestrado foi julgada e aprovada para a obtenção do títulode Mestre em Imunologia pela Pós-Graduação em Imunologia da Universidade Federal da Bahia. Salvador, 16 de dezembro de 2008. BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO: Adelmir Macado Lourdes Farré Orientadores da dissertação de mestrado: Theolis Costa Barbosa Bessa Sérgio Arruda 3 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho a Theolis Barbosa, pelo convite, quando ainda fazia graduação, para fazer parte deste projeto. Por ter confiado em mim e ensinado com tanta paciência os segredos da imunologia, e principalmente, por fazer do ambiente de trabalho, um lugar prazeroso de se conviver. 4 AGRADECIMENTOS Agradeço aos meus pais, Vanda e Elício, pelo carinho e por terem sido meus primeiros financiadores, sem precisar submeter projetos para ter seu apoio incondicional. Aos meus irmãos e amigos pelos necessários momentos de descontração e alegria. A Eduardo, meu esposo, que significa meu cantinho seguro, onde buscamos juntos participar do crescimento um do outro e dessa forma tudo fica mais fácil. Aos voluntários que aceitaram participar do estudo. Ao PPGIM, em especial à Dilceia, Profª Songeli Freire, Maria de Fátima Dias Costa e Profº Roberto Meyer. Aos colegas, em especial a Luciana Aragão, Sandra Dorea, Patrícia Cisneiros e Marcos Herculano. Ao LIMI-FIOCRUZ/Ba, coordenado por Dr.Barral. A Jorge Tolentino e Nátali Cerqueira, que sempre me ajudaram e são a alegria do laboratório. A Gilvaneia Santos, George, Johan Van Weyenbergh, Jorge Clarêncio pela amizade e apoio com citometria, reagentes ou sugestões de trabalho. Aos participantes do Projeto BCG, dentre eles, Maurício Cardeal, pela ajuda com as análises estatísticas, Dr. Jamocyr, Régis e Francisco Sampaio pelas colaborações e aos meus amigos Jaqueline Soledade, Elisabete Conceição, Maurício Pedrosa, Iukary Takenami, Tonya Duarte, Joilda Nery, Cleriston Farias. A Dr. Adelmir Machado e Dra. Lourdes Farré pelas importantes críticas e sugestões ao trabalho. Ao Dr. Sérgio Arruda pelos ensinamentos, conselhos, reclamações e piadas na hora do cafezinho. À Dra. Theolis Barbosa, que mesmo a distância, foi uma orientadora presente. Por indicar o melhor caminho, sem percorrê-lo para mim. Pela amizade e madrugadas de CBA regado a chocolate, pipoca e café. A Deus, por ter colocado em minha vida, todas essas pessoas citadas acima. 5 RESUMO Introdução. A tuberculose (TB) é uma doença crônica infecto-contagiosa, presente nos principais casos de morbidade-mortalidade nos países em desenvolvimento. Estima-se que 2 bilhões de pessoas no mundo estão infectadas pelo Mycobacterium tuberculosis e cerca de 10% destes tem risco de desenvolver a doença. Desde 1921, a única vacina utilizada contra tuberculose é o Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) e mesmo com o uso, a TB ainda é uma das principais causas de morte por agentes patogênicos. A imunidade celular adquirida após vacinação com BCG é mais efetiva contra a infecção disseminada do que contra a doença pulmonar. São poucas as pesquisas que avaliam a resposta a revacinação e geralmente esses estudos são de acompanhamento ou abrange pequeno número de voluntários. A pesquisa de novas vacinas vem sendo comprometida pelas poucas correlações da imunidade protetora, por isso, a avaliação de marcadores que possam correlacionar com a proteção contra a doença pode facilitar a identificação de novos candidatos vacinais contra TB. Objetivo. Neste trabalho, nós avaliamos a produção de citocinas potencializadoras da resposta imune celular, nomeadamente o IFN-g e o TNF, a produção de citocinas modulatórias como a IL-10 e a geração de células TCD8+IFN-g + como potenciais marcadores imunológicos de proteção contra a TB. Metodologia. Voluntários entre universitários da área de saúde, submetidos ao teste tuberculínico (TST), e que foram previamente vacinados com BCG. Após consentimento informado, voluntarários TST negativos foram divididos em dois grupos: 50 estudantes foram revacinados com BCG e 30 foram controles. Foram coletados vinte mililitros de sangue nos tempo 0, 2 e 12 meses após revacinação. As culturas foram mantidas por 72h com ou sem 10 ug/ml de antígenos do lisado de Mycobacterium tuberculosis a 370C, 5% CO . Os sobrenadantes foram avaliados para medir os níveis de 2 citocinas usando citometria de fluxo bem como as frequências de células TCD8+IFN-g +. Resultados e discussão. Foram observados aumento dos níveis de IFN-g nos revacinados quando comparados aos controles 2 meses e 1 ano após a intervenção, semelhantes aos resultados encontrados em trabalho anterior do grupo. Não foram observadas diferenças entre o produção de TNF e IL-10 entre os grupos. Indivíduos do mesmo grupo revacinado apresentaram melhor resposta à revacinação, observados através da alta produção de IFN-g e expansão de células TCD8+IFN-g + um ano pós- BCG, mostrando também, persistência da resposta. Houve pequena correlação entre tamanho da cicatriz e expansão de células TCD8+ produtoras de IFN-g +. Conclusão. A revacinação é capaz modular a resposta imune aumentando a produção de IFN-.g Neste trabalho, ainda identificamos a persistência da resposta através da expansão de células TCD8+ produtora de IFN-.g Sugerimos que novos modelos vacinais sejam desenvolvidos levando em consideração o importante papel das células CD8+IFN-g +, além do conhecimento de que a resposta é diferenciada na população, portanto, é necessário desenvolver uma vacina que possa abranger indivíduos com infecção latente, já sensibilizados anteriormente com cepa vacinal ou micobactérias atípicas ou ainda com alguma suscetibilidade genética. Palavras-chaves: Mycobacterium tuberculosis, vacina BCG, revacinação, citocinas, IFN-gama, células CD8, tuberculose. 6 ABSTRACT Introduction. Tuberculosis (TB) is a chronic, infectious and contagious disease, present in most of morbidity and mortality cases in developing countries. It is estimated that 2 billion of people worldwide are infected with Mycobacterium tuberculosis and about 10% of that has a risk of developing the disease. Since 1921 the only vaccine against tuberculosis is the use of Bacillus Calmette-Guerin (BCG) and even with the use of this vaccine TB is still the major cause of deaths from pathogens. The acquired cellular immunity after vaccination with BCG is more effective against spread infection than against lung disease. There are few studies that evaluate the response to revaccination, generally these studies are follow-up or cover small number of volunteers. The research concerning new vaccines has been hampered by low correlations of protective immunity so the evaluation of markers that may correlate with protection against disease may facilitate the assessment of new vaccine against TB. Objective. In this study we evaluated the production of enhanced cytokines from the cellular immune response IFN-g e o TNF the production of cytokines such as IL-10 and the production of TCD8+IFN-g+ cells as markers for immunological protection against the TB. Methods. Volunteers were recruited among university students of health care areas; they were all submitted to the tuberculin skin test (TST) and were previously vaccinated with BCG. After consent, volunteers with negative TST were divided into two groups: 50 students were revaccinated with BCG and 30 were controls. Twenty milliliters of blood were collected in 0, 2 and 12 months after revaccination. The cultures were kept for 72 hours with or without 10 ug/ml of lysate antigens of Mycobacterium tuberculosis at 370C, 5% CO2. The supernatants were assessed to measure the levels of cytokines using flow cytometry and frequency of cells TCD8+IFN-g + . Results and Discussion. Was observed that levels of IFN-g increased in revaccination when compared to controls with 2 months and 1 year after intervention, similar to results in previous work of the group. There were no differences between the production of TNF and IL-10 between groups. Revaccinated individuals of the same group showed better response to its revaccination, observed by a high production of IFN-g and expansion of cells TCD8+IFN-g + one year post-BCG, showing also persistence of the response. There was little correlation between the size of the scar and expansion of TCD8+ who produces IFN-g . Conclusion. The revaccination is able to modulate immune response by increasing the production of IFN-g . In this study was also identified the persistence of response through the expansion of TCD8+ who produces IFN-g . We suggest that new vaccine should be developed taking into consideration the important role of CD8+IFN- g + cells. Beyond the knowledge that the answer is different in population, so it is necessary to develop a vaccine that could include individuals with latent infection, previously sensitized with strain vaccine or atypical mycobacteria or even with some genetic susceptibility. Key words: Mycobacterium tuberculosis, BCG vaccine, revaccination, cytokines, IFN- gamma, CD8 cells, tuberculosis. 7 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Estimativa do número de novos casos de tuberculose, por país, 2006. 25 Figura 2. Principais características da tuberculose: da infecção a defesa do 28 hospedeiro. Figura 3. Preparação das diluições do padrão para análises de citocinas. 43 Figura 4. Produção de IFN- g em culturas de sangue total de voluntários em 45 meio sem estímulo, estimulado com antígeno micobacteriano (Mtb) ou antígeno não relacionado (Derp). Figura 5. Análise por citometria de fluxo de células TCD8+IFN-g + . 48 Figura 6. Fotografias da lesão vacinal dos voluntários revacinados com BCG. 56 Figura 7. Produção de citocinas em culturas de sangue total de voluntários 60 revacinados ou controles com ou sem estímulo por antígeno micobacteriano (MtbAg), dois meses após a primeira coleta. Figura 8. Produção de citocinas em culturas de sangue total de voluntários 61 revacinados e controles, nos tempos zero e dois meses após a primeira coleta. Figura 9. Correlações entre níveis de citocinas em culturas de sangue total de 62 voluntários revacinados e controles, no tempo de dois meses. Figura 10. Produção de IFN-g em culturas de sangue total estimuladas com 63 MtbAg, nos tempos zero e dois meses após a primeira coleta, nos subgrupos com alta responsividade e com baixa responsividade. Figura 11. Produção de IFN-g em culturas de sangue total estimuladas com 64 antígeno, dois meses após a primeira coleta, nos subgrupos com alta responsividade e com baixa responsividade. Figura 12. Correlações entre níveis de citocinas em culturas de sangue total de 65 voluntários com alta responsividade e com baixa responsividade, no tempo de dois meses. Figura 13. Correlação entre níveis de TNF e IL-6 entre indivíduos com alta 65 responsividade e com baixa responsividade. 8 Figura 14. Avalição da produção de IFN-g em culturas de sangue total de 67 indivíduos revacinados com BCG e controles, nos tempos zero, dois meses e 12 meses após a primeira avaliação. Figura 15. Avaliação dos níveis de IFN-g nos tempos zero, dois meses e doze 68 meses após revacinação com BCG. Figura 16. Produção de IL-10 em culturas de sangue total estimuladas com 69 antígeno. Figura 17. Correlações entre níveis de citocinas em culturas de sangue total de 69 voluntários com alta responsividade e com baixa responsividade na análise de um ano pós-BCG. Figura 18. Expansão dos linfócitos T CD8+IFN-g + em culturas de sangue total 70 nos tempos zero, dois meses e doze meses após a primeira avaliação. Figura 19. Razão entre a proporção de células T CD8+IFN-g + em culturas de 71 sangue total nos tempos dois meses e doze meses após a primeira avaliação e a proporção de células T CD8+IFN-g + no tempo zero. Figura 20. Avaliação da correlação entre o tamanho da cicatriz (em cm) 72 formada dois meses após a revacinação e a proporção de células CD8+IFN-g + Figura 21. Análise da cicatriz e da lesão pós-vacinação. 73 9 LISTA DE TABELAS Tabela 1–Características sócio-demográficas da população do estudo e 50 exposição ao M. tuberculosis. Tabela 2 – Total de perdas de voluntários que não retornaram para leitura do 51 primeiro teste tuberculínico ou que não retornaram para aplicação e leitura do segundo TST durante o estudo, descrito entre os cursos e entre sexo. Tabela 3- Características sócio-demográficas e exposição ao M. tuberculosis 54 entre os voluntários dos grupos revacinado e controle. Tabela 4 – Características da lesão vacinal dos voluntários que compareceram 55 na primeira semana após a revacinação e o acompanhamento após um e dois meses. Tabela 5- Valores do hemograma obtidos a partir da média dos exames da 57 coleta sanguínea realizada no tempo 0, após 2 meses e 1 ano da revacinação. Tabela 6- Produção de citocinas no sobrenadante de culturas de sangue total 59 cultivadas com estímulo de antígeno total lisado do M.tuberculosis e sem estímulo, no tempo zero. Tabela 7 – Avaliação de citocinas em culturas de sangue total estimuladas com 64 antígeno, 2 meses pós-BCG, para os voluntários com alta responsividade e com baixa responsividade . Tabela 8- Avaliação da produção de citocinas em culturas de sangue total, 66 estimuladas ou não com antígeno (MtbAg), um ano após a primeira avaliação, para voluntários revacinados e controles. Tabela 9- Avaliação da produção de citocinas em culturas de sangue total 67 estimuladas ou não com antígeno, para voluntários revacinados e voluntários controles, nos tempos zero (T0), dois meses (T2) e um ano (T12) após a primeira avaliação. Tabela 10. Avaliação da produçao de citocinas em culturas de sangue total 68 estimuladas com antígeno, no tempo de 12 meses pós-BCG, para voluntários com alta responsividade e com baixa responsividade. Tabela 11. Expansão in vitro dos linfócitos T CD8+IFN-g + por estímulo com 71 antígeno em culturas de sangue total de indivíduos com alta responsividade e com baixa responsividade nos tempos zero (T0), dois meses (T2) e um ano (T12) pós-BCG. 10