UNIVERSITE PARIS-SUD ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES DU VEGETAL Equipe Méiose et Recombinaison DISCIPLINE: BIOLOGIE Thèse de Doctorat Soutenue le 14/02/2014 Par Marina TAGLIARO JAHNS Etude du rôle de la neddylation dans la régulation de la recombinaison méiotique Composition du jury: Directrice de thèse: Mathilde GRELON DR INRA, IJPB Versailles Rapporteurs: Valérie BORDE DR CNRS, Institut Curie, Paris Anne-Marie CHEVRE DR INRA, IGEPP, Le Rheu Examinateurs: Pascal GENSCHIK DR CNRS, BPMP, Montpellier Jean-René HYUHN CR CNRS, Institut Curie, Paris Olivier MARTIN Prof Université Paris Sud, Orsay 1 Remerciements Je tiens tout d’abord à remercier les membres de mon jury, Valérie Borde, Anne-Marie Chèvre, Pascal Genschik, Jean-René HUYNH et Olivier MARTIN, pour avoir accepté d’évaluer ce travail. Je remercie très chaleureusement ma « chefinha », Mathilde Grelon, une personne exceptionnelle et toujours souriante, pour sa patience, pour toutes les enseignements et pour avoir partagé son immense connaissance de la méiose pendant ces trois années. Je tiens à remercier Daniel Vezon (sans doute le plus beau sourire de Versailles) pour toute son aide, pour avoir supporté mes mutants pourris et pour en avoir fait des miracles afin d’obtenir des belles images même quand cela semblait impossible. Je te remercie de tout mon cœur pour ta gentillesse, qui m’a beaucoup aidé à tenir le coup pendant des moments très difficiles. Tu seras toujours dans mon cœur. Je remercie également Aurélie Chambon, qui m’a appris plein des manips au début de la thèse, et qui a été indispensable pour que je la finisse. Je te remercie beaucoup pour ta gentillesse, pour ton aide et pour ta patience. Aurélie, avec les filles du labo, ont été des personnes très importantes dans des moments de détente, pendant les déjeuners, les pauses thé et les soirées bières! Un grand merci à toute l’équipe « méiose et recombinaison », qui a contribué de plusieurs façons à ma thèse. Ça a été un vrai plaisir de travailler dans cette équipe et j’en suis fier ! Un merci aussi à mes amis ex-méioses et recombinaison Marta, Waynito et Afefinha. Je remercie beaucoup ma famille, qui même de très loin a toujours été à mes côtés, pour m’appuyer et me donner un coup de pouce dans les périodes difficiles que nous avons traversé ensemble. Un remerciement spécial à ma maman et mon papa (in memoriam) qui m’ont toujours stimulés à poursuivre mes rêves, même si ça m’emmènerais très loin d’eux. Un merci spécial à Toufik, pour prendre soins de moi toujours si bien et pour tout ce qu’il est. Je dédie cette thèse à ma famille et à Toufik, les gens que comptent les plus au monde pour moi. 2 3 "It is not enough to have knowledge, one must also apply it. It is not enough to have wishes, one must also accomplish." Johann Wolfgang von Goethe (1808) 4 5 Abbreviation’s List ATP: Adenosine triphosphate A. thaliana: Arabidopsis thaliana AE: Axial element APC/C: Anaphase Promoting Complex/Cyclosome AXR1: auxin resistant 1 CAND1: CULLIN-ASSOCIATED NEDD8-DISSOCIATED 1 C. elegans: Caenorhabditis elegans CE: Central element CO: Crossover CRL: Cullin-RING Ligase CSN: COP9 Signalossome D. melanogaster: Drosophila melanogaster dHJ: double Holliday junction D-loop: Displacement loop DNA: Deoxyribonucleic acid DSB: Double-strand break EN: Early nodule FISH: Fluorescent in situ hybridization LE: Lateral element LN: Late nodule MCN: Minimum chiasma number M. musculus: Mus musculus mRNA: Messenger RNA NCO: Non-crossover NER: Nucleotide-excision repair NHEJ: Non-homologous end-joining O. sativa: Oryza sativa RNA: Ribonucleic acid RNAi: RNA interference S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae S. pombe: Schizosaccharomyces pombe SC: Synaptonemal Complex SDSA: Synthesis-dependant strand annealing SEI: Single end invasion T-DNA: transfer DNA UV – Ultraviolet light 6 7 List of tables and figures INTRODUCTION Figure 1: Meiosis Figure 2: Mitosis Figure 3: Non-disjunction in the first segregation event Figure 3: Connections formed between homologous chromosomes during meiosis Figure 4: Schematic representation of the five meiotic prophase I stages Figure 5: Leptotene Figure 6: The Axial Element (AE) Figure 8: Bouquet formation Figure 9: Zygotene Figure 10: Synaptonemal complex formation Figure 11: Early recombination nodules (ENs) Figure 12: Pachytene Figure 13: Locusta migratoria synaptonemal complexes (SCs) Figure 14: Diplotene and diakinesis Figure 15: Metaphase I and anaphase I Figure 16: Metaphase II, anaphase I and telophase II Figure 17: Cohesin complex Figure 18: Loss of cohesion Figure 19: Condensin complexes Figure 20: Synaptonemal complex formation Figure 21: DSB repair model Figure 22: DSB formation proteins in S. cerevisiae Figure 23: DSB localisation models Table 1: DSB formation proteins Figure 24: Spo11 removal and DSB-end resection Figure 25: Bidirectional DSB end resection Figure 26: Single-end invasion Figure 27: Inter-homolog (IH) bias Figure 28: Role of DMC1 in homologous DSB repair Figure 29: NCO formation Table 2: Class I CO formation genes Figure 30: Revised DSB Repair Model Figure 31: Interference models Figure 32: The ubiquitylation cascade Figure 33: Composition of a CRL (Cullin-RING Ligase) Figure 34: Classes of CRLs Table 3: Number comparison of cullin-RING ligase adaptors among selected eukaryotes Figure 35: Role of CRL4 and ubiquitylation in Nucleotide Excision Repair Table 4: DDB1-interacting proteins in A. thaliana 8 Figure 36: CRL Regulation Figure 37: Stimulation of CRL activity by neddylation Figure 38: Neddylation modifies cullins Figure 39: Comparison of the ubiquitylation pathway (left) to the neddylation pathway (right) Figure 40: Deneddylation by the COP9 Signalosome (CSN) Figure 41: Hyperneddylation and hyponnedylation lead to the same phenotype Figure 42: CAND1 binding to CRLs Figure 43: Hypothesis for Control of CRL Assembly by Substrate Figure 44: Model of CRL Regulation Cycle Figure 45: axr1 Mutation Leads to Accumulation of Auxin Repressors RESULTATS First article Figures and Tables Fig. 1 The ecr1-1 mutant Fig. 2 Phenotypes of described ECR1C215A transgenic lines Fig. 3 rce1 mutants Fig. 4 Phenotype of described rce1-1 mutant Fig. 5 Phenotypes of RBX1 overexpression lines Table 1: List of neddylation mutants analysed in this work Fig. 6 Phenotypes of csn5a mutants Fig. 7 Meiotic phenotype of csn5a mutant Fig. 8 Phenotype of cul1 plants Fig. 9 Chromosome DAPI staining of male meiocytes Fig. 10 Metaphase I cells from auxin signalling mutants Table 2: List of all auxin-signalling genes analysed in this work Fig. 11 ASCUL4 and cul3w meiosis Fig. 12 Vegetative phenotype of wild-type and ascul4 plants Fig. 13 Meiotic phenotype of ddb1 and ddb2 mutants Table 3: CRL4-interacting proteins analysed in this work Fig. 14 Phenotype of cand1 plants Fig. 15 Pollen formation in cand1-3 mutants and wt Fig. 16 DAPI staining of cand1-3 male meiocytes Fig. 17 Absence of bivalent formation Fig. 18 Evidence of chromosome fragmentation or cohesion loss Fig. 19 Immunostaining of DMC1 proteins Fig. 20 Chromosome axes immunolabeling Fig. 21 Immunolocalisation of MLH1 protein Fig. 22 Frequency of chiasmata in different mutants Fig. 23 DAPI staining of male meiocytes Fig. 24 Epistasis analysis showing the mean number of bivalents per cell in cand1-3 and each double mutant 9