Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. Maestría en Ciencias en Ciencias de la Vida con orientación en Microbiología Comparación de la hidrofobicidad de la cutícula foliar en plantas de tres humedales costeros de Baja California, México Tesis para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el título de Maestro en Ciencias Presenta: Luis Eduardo Tellechea Robles Ensenada, Baja California, México 2017 Tesis defendida por Luis Eduardo Tellechea Robles y aprobada por el siguiente comité Dr. Rodrigo Méndez Alonzo Director de tesis Dr. Rubén Darío Cadena Nava Dr. Stephen Holmes Bullock Runquist Dr. Israel Marck Martínez Pérez Dra. Clara Elizabeth Galindo Sánchez Coordinadora del Posgrado en Ciencias de la Vida Dra. Rufina Hernández Martínez Directora de Estudios de Posgrado Luis Eduardo Tellechea Robles © 2017 Queda prohibida la reproducción parcial o total de esta obra sin el permiso formal y explícito del autor y director de la tesis ii Resumen de la tesis que presenta Luis Eduardo Tellechea Robles como requisito parcial para la obtención del grado de Maestro en Ciencias en Ciencias de la Vida con orientación en Microbiología. Comparación de la hidrofobicidad de la cutícula foliar en plantas de tres humedales costeros de Baja California, México Resumen aprobado por: Dr. Rodrigo Méndez Alonzo Director de tesis Las plantas dominaron el medio terrestre mediante el desarrollo de la cutícula, que es una capa impermeable alrededor de los tejidos externos que permite la liberación controlada de agua a través de espacios selectivos. La caracterización de la repelencia al agua (hidrofobicidad), es un tema de interés debido a las implicaciones ecológicas y evolutivas del desarrollo de estas estructuras y por su posible utilidad como inspiración de materiales sintéticos. Se ha observado en estudios previos que las especies de humedales tienen características contrastantes de hidrofobicidad, abarcando desde especies hidrofílicas hasta especies altamente hidrofóbicas; sin embargo, no se han realizado estudios que cuantifiquen esta propiedad entre especies y comunidades en diferentes humedales. En esta tesis cuantifiqué la hidrofobicidad de las cutículas foliares de especies de plantas de humedales costeros de Baja California, bajo diferentes condiciones de inundación por medio del método de ángulo de contacto estático, microscopía electrónica de barrido (SEM) y estadísticos que sintetizan la información de caracteres a nivel comunidad. Se determinó que la hidrofobicidad, cuantificada por ángulo de contacto, tuvo un promedio ponderado por cobertura de las especies, de 77°, 93° y 100° por laguna. Tomando en consideración un umbral de 90° ± 10°, se encontraron 22 especies hidrofóbicas y 15 especies hidrofílicas. Además, se caracterizaron las estructuras cuticulares de las especies con comportamientos superhidrofílico y superhidrofóbico, donde estas últimas poseían diversas formas de indumentos epicuticulares tales como rodeles, tricomas y capas sobrepuestas. Estas estructuras posiblemente juegan un papel importante en la permeabilidad de las hojas, en el redireccionamiento de humedad hacia las raíces y otras funciones. En conjunto, los resultados de esta tesis permitieron hacer una comparación en la hidrofobicidad foliar de distintas comunidades vegetales, tomando en cuenta la abundancia relativa de cada una de las especies en los diversos sitios. En comparación con plantas de ambientes ajenos a humedales, los humedales costeros poseen un valor de ángulo de contacto más elevado (88° ± 14) que otras comunidades vegetales (74° ± 21), lo cual sugiere que las comunidades de humedales, aún sin ser estrictamente hidrofóbicas, poseen una alta variabilidad entre las diferentes especies y formas de vida. Palabras clave: Ángulo de contacto, cutículas foliares, hidrofobicidad, humedales costeros, materiales bioinspirados, microscopia electrónica de barrido. iii Abstract of the thesis presented by Luis Eduardo Tellechea Robles as a partial requirement to obtain the Master of Science degree in Life Sciences with orientation in Microbiology Comparison of the foliar cuticular hidrophobicity in plants of three coastal wetlands in Baja California, Mexico. Abstract approved by: Dr. Rodrigo Méndez Alonzo Thesis director Plants were able to dominate terrestrial environments because of the development of a non-wetting waxy outer layer around their body, which limits water outflow to selective spaces. Particularly, the most important tissue determining plant wettability is the cuticle. The hydrophobicity of the cuticles (the capacity of repel or attract water droplets), and the physical and structural characterization of cuticle components, is a very interesting topic due to ecological and evolutionary implications, and due to their potential use as an inspiration for synthetic materials. In previous studies, it has been observed that wetland species have different water-repellency behavior, from highly hydrophobic species to highly hydrophilic species. Nevertheless, the ecological advantage of these traits and how they vary across different types of wetlands it is not known. In my thesis, I quantified the hydrophobicity of plant cuticles in three coastal wetlands of Baja California, under different conditions of inundation, using the contact angle method, scanning electron microscopy (SEM), and different statistical methods which summarizes information of community data. I found that the average hydrophobicity, using the contact angle values of the three wetlands, Estero de Punta Banda, La Lagunita El Ciprés and La Misión, were of 93°, 77° and 100° respectively. I also found 22 hydrophobic species and 15 hydrophilic species, using a treshold value of 90° ± 10°. In addition, the cuticular structures from superhydrophobic and superhydrophyllic species were analyzed, and I found several forms of epicuticular induments, such as trichomes, rodlets and palets in superhydrophobic species. This type of structure might play an important role in leaf permeability, water redirection to the roots and other functions. All together, the results from this thesis allow a comparison between plant communities through the community weighted mean for hydrophobicity, using the relative abundance of each species in all the sites. In comparison with other plant communities from around the world (74° ± 21), wetlands had higher values of contact angle values (88° ± 14), thus suggesting that coastal wetlands have a higher average hydrophobicity value than other vegetal communities, due to a high variability in species and life forms, in spite of not all species being strictly hydrophobic. Key words: Bioinspired materials, coastal wetlands, contact angle, foliar cuticle, hydrophobicity, scanning electron microscopy. iv Dedicatoria A mis padres, Eduardo Tellechea Armenta y Martha Gabriela Robles Arredondo, y a mi hermana Ana Gabriela Tellechea Robles, por el apoyo y amor incondicional que me brindaron durante estos dos años. v Agradecimientos Agradecezco al posgrado en Ciencias de la Vida del CICESE (15293925). Agradecezco el apoyo por la beca de maestría 337941 a CONACYT . Al Proyecto Ecofisiología y ecología funcional de plantas de ambientes estresados, número de clave, B0F084-681-117. Proyecto CONACYT, PN-2015-1-251. Al Dr. Rodrigo Méndez Alonzo, por su gran entrega y dedicación al desarrollo de esta tesis y por siempre haber estado para mí cuando lo necesité. Al Dr. Stephen Bullock, Dr. Israel Martínez y al Dr. Rubén Cadena, por siempre haber estado al pendiente de mis avances, su asesoría y sus constructivos comentarios y sugerencias para mi trabajo. Un especial agradecimiento a Mario Salazar, Eulogio López y Fabián Alonso, quienes meapoyaron técnicamente en diferentes aspectos de la investigación. A Iván Manriquez, de grupo ProEsteros, y al Dr. Diego Delgado. A mis padres, Eduardo Tellechea y Gabriela Robles, mi hermana Ana Gabriela Tellechea, las personas que más amo; porque aún estando a distancia, sentí su incondicional apoyo y amor cada día. A mis tíos, Marcela, Marcos, Yael, Arturo y Alma Delia, por haber siempre estado al pendiente de mis avances durante estos dos años. A mis amigos, Tania Burgos, Tadeo De La Cruz, Ángel Ortega, Renee Mange, Jorge Jiménez, Heriberto Encinas, Sergio Garza, Julio Padilla, Rafael Martínez, Nadir Carreón, Nadia Contreras y Oscar Morales; por siempre preocuparse y por querer siempre saber cómo iba mi tesis, y por acompañarme a distancia con sus ánimos y por siempre recibirme con gusto cuando coincidíamos en Hermosillo. A mis amigos, compañeros de la generación 2015-2017 del Posgrado en Ciencias de la Vida; Víctor Vargas, Eduardo Álvarez, Arlette Pacheco, Iván González, Joel Ricci, Vanessa Vázquez, Duahmet Ruíz y Fernanda Ariza; por lograr influir, cada quien a su manera, en mi crecimiento, tanto profesional como personal. vi Lista de figuras Página 1 Capas que conforman la cutícula foliar en una célula vegetal (Koch y Barthlott, 2009). ……………………………………………………………………………………………………………………………….…. 2 2 Superhidrofobicidad foliar de la hoja de Loto (Nelumbo nucifera). ………………………….. 4 3 Corte transversal de un fragmento foliar, donde se distinguen los diversos indumentos (pliegues y tricomas) en la superficie de la cutícula, así como la composición interna de la hoja. …………………………………………………………………………………………….………………….. 5 4 Colección de imágenes de ceras epicuticulares, obtenidas de microscopio SEM. Es posible apreciar las diferentes morfologías estructurales que presenta cada una de las especies y, dependiendo de éstas, será el comportamiento menor o mayormente hidrofóbico (Barthlott et al., 1998). …………………………..……………………..……………………… 7 5 Humedal de La Lagunita, El Ciprés, Ensenada, B.C. ………………………………………..………… 8 6 Diagrama que representa los efectos del gradiente de inundación y la periodicidad de ésta en la fisiología de las plantas de los humedales. ………………………………………………. 10 7 Diagrama que muestra el comportamiento de una gota de agua en relación a diversos tipos de superficie, donde varía el grado de interacción de ésta con el substrato correspondiente (Krasowska et al., 2009). ……………………………………………………………….. 11 8 Recopilación por Goldsmith et al. (2016) de los ángulos de contacto promedio entre especies en diversos sitios y habitats del mundo. ………………........................................ 12 9 Alfa, Beta y Gamma diversidad. La partición de la variación en diversidad conforme diferentes paisajes o regiones se puede entender de la siguiente manera: Alfa-diversidad es medida localmente en un sitio único, por ejemplo el sitio 1 y el sitio 2, donde el sitio 1 posee mayor Alfa-diversidad que el sitio 2. Beta-diversidad se mide tomando en cuenta el cambio en la composición de especies o a través de un gradiente, tales como las regiones X y Y, donde la región Y posee una mayor Beta-diversidad que la región X, así como un mayor intercambio de especies entre los sitios de la región Y. Gamma-diversidad es similar a la Alfa-diversidad, solo que a una escala mucho mayor, Alfa y Beta diversidad contribuyen a la Gamma-diversidad. La región X posee una Alfa-diversidad mayor en sus sitios, pero son muy similares entre ellos; sin embargo, la misma región posee una baja Beta-diversidad y una moderada Gamma-diversidad. De la misma manera, la Región Y posee una baja Alfa- 14 diversidad en sus sitios, pero estos difieren mucho entre ellos; por lo tanto, la región vii posee una alta Beta-diversidad y una mayor Gamma-diversidad que la región X (modificado de Perlmany Adelson, 1997). 10 Mapa satelital del sitio de muestreo en el Estero de Punta Banda, donde cada vértice de la cuadrícula indica las coordenadas del trazo de los transectos para la medición de biodiversidad (16). ………………………………………………………………………………………………. 18 11 Imagen panorámica del sitio de muestreo en el Estero de Punta Banda. …………………. 19 12 Imagen representativa de la cobertura de las plantas encontradas en un fragmento del transecto, cuya área es de 1 metro cuadrado, limitada por los postes de color naranja. ……………………………………………………………………………………………………………………. 19 13 Transecto de 10 x 1m para identificación de las especies, trazado en el Estero de Punta Banda así como su cobertura a lo largo de éste. ………………………………………………………. 20 14 Bandera colocada en el punto de muestreo #10. ………………………………………….………….. 20 Mapa satelital del sitio de muestreo en La Lagunita (El Ciprés), donde cada vértice de 15 la cuadrícula indica las coordenadas del trazo de los transectos para la medición de biodiversidad (20). ……………………………………………………………………………………………………. 21 16 Panorámica del sitio de muestreo de La Lagunita (El Ciprés). ……………………….………….. 22 17 Mapa satelital del sitio de muestreo en La Misión, donde cada vértice de la ruta indica las coordenadas del trazo de los transectos para la medición de biodiversidad (10, zona norte). ……………………………………………………………………………………………………………… 23 18 Mapa satelital del sitio de muestreo en La Misión, donde cada vértice de la ruta indica las coordenadas del trazo de los transectos para la medición de biodiversidad (10, zona sur). …………………………………………………………………………………………………………………. 24 19 Panorámica del arroyo del humedal de La Misión. …………………………………………………… 24 20 Esquema del aparato utilizado para medir el ángulo de contacto para cada una de las hojas seleccionadas para cada especie. ………………………………………………….…………………. 25 21 Teléfono celular (Motorola Moto X XT-1096, segunda generación) utilizado para la captura de imágenes de ángulos de contacto. …………………………………………………………. 26 22 Lente macro ajustable utilizado para el enfoque cercano de las gotas en la superficie foliar. ……………………………………………………………………………………………………………………….. 27 23 Medición de ángulo de contacto entre la gota de agua y la superficie foliar de la planta Dudleya brittoni, cuyo valor corresponde a 107.59o. ………………………………………………… 28 viii 24 Montaje de los fragmentos de cada una de las especies visualizadas bajo el microscopio, aproximadamente 3 mm2 de área para cada una. …………………….………….. 29 25 Microscopio SEM Hitachi SU3500, utilizado para observar la microestructura foliar de las especies de interés. ……………………………………………………………………………………………. 30 26 Curva de acumulación de especies para el humedal de Punta Banda, Baja California, México. El muestreo se realizó el 25 de noviembre de 2016. La curva de acumulación de la riqueza de especies encontradas se compara con tres estimadores de riqueza total de especies. ICE es el Incidence-Based Coverage Estimator, Jacknife 1 es un modelo de ajuste no paramétrico basado en Jacknife de primer orden y Chao1 es el modelo de ajuste asintótico de Chao (Coldwell y Coddington 1992). La riqueza encontrada se ajustó a un modelo asintótico S = a × (1 – e-b × No. de sitios), donde a y b son parámetros de la regresión. ………………………………………………………………………………. 35 27 Curva de acumulación de especies para el humedal de La Lagunita El Ciprés, Baja California, México. El muestreo se realizó el 9 de febrero de 2017. La curva de acumulación de la riqueza de especies encontradas se compara con tres estimadores de riqueza total de especies. ICE es el Incidence-Based Coverage Estimator, Jacknife 1 es un modelo de ajuste no paramétrico basado en Jacknife de primer orden y Chao1 es el modelo de ajuste asintótico de Chao (Coldwell y Coddington 1992). La riqueza encontrada se ajustó a un modelo asintótico S = a × (1 – e-b × No. de sitios), donde a y b son parámetros de la regresión. ……………………………………………………………………………………… 36 28 Curva de acumulación de especies para el humedal de La Misión, Baja California, México. El muestreo se realizó el 24 de marzo de 2017. La curva de acumulación de la riqueza de especies encontradas se compara con tres estimadores de riqueza total de especies. ICE es el Incidence-Based Coverage Estimator, Jacknife 1 es un modelo de ajuste no paramétrico basado en Jacknife de primer orden y Chao1 es el modelo de ajuste asintótico de Chao (Coldwell y Coddington 1992). La riqueza encontrada se ajustó a un modelo asintótico S = a × (1 – e-b × No. de sitios), donde a y b son parámetros de la regresión. ………………………………………………………………………………………………………… 37 29 Histograma de frecuencias entre los tres sitios de muestreo, tomando en cuenta la variable de ángulo de contacto contra la frecuencia de especies por intervalo. ……….. 39 30 Variación en el ángulo de contacto estático en tres humedales costeros de Baja California, México. Estero de Punta Banda (EPB), La Lagunita El Ciprés (LC) y La Misión (LM). F = 24.43, BF > 107 . Los puntos corresponden al valor de la media del ángulo de contacto y los bigotes corresponden a la desviación estándar de los valores. ………………………………………….……………………….……………………………………………………………… 39 31 Variación en el ángulo de contacto estático de especies provenientes de tres humedales costeros de Baja California, México entre zonas de inundación. Acuáticas (AC), Inundadas (I), No inundadas (NI), semiinundadas (SI). F = 24.43, BF > 107. Los puntos corresponden al valor de la media del ángulo de contacto y los bigotes corresponden a la desviación estándar de los valores. …………………………………………….. 40 ix 32 Variación en el ángulo de contacto estático promedio, por humedal, tomando en cuenta la media ponderada del ángulo de contacto estático de las hojas por 40 comunidad (CWM, community weighted mean). Los puntos corresponden al CWM del ángulo de contacto y las barras de error corresponden a la amplitud funcional, que es el valor máximo y el mínimo encontrados por todos los individuos de cada laguna. …. 33 Histograma de frecuencias entre las especies del Estero de Punta Banda, tomando en cuenta la variable de ángulo de contacto contra la frecuencia de especies por intervalo. ……………………………………………………………………………………..………………………….. 41 34 Histograma de frecuencias entre las especies de La Lagunita El Ciprés, tomando en cuenta la variable de ángulo de contacto contra la frecuencia de especies por intervalo. …………………………………………………………………………………………………………………. 42 35 Histograma de frecuencias entre las especies de La Misión, tomando en cuenta la variable de ángulo de contacto contra la densidad de individuos por intervalo. ……… 42 36 Imágenes de las especies más hidrofóbicas, ordenadas de mayor (1) a menor (9) ángulo de contacto. (1) Anemopsis californica, (2) Polypogon montspeliensis, (3) Scirpus sculentus, (4) Typha domingensis, (5) Distichlis spicata, (6) Ambrosia psilostachya, (7) Salsola tragus, (8) Camisoniopsis cheirantipholia, (9) Malva parviflora. ………………………………………………………………………………………………………………… 44 37 Imágenes de las especies más hidrofílicas, ordenadas de mayor (1) a menor (7) ángulo de contacto. (1) Juncus acutus, (2) Isocoma menziessi, (3) Salicornia bigelovii, (4) Dudleya sp., (5) Scoenoplectus californicus, (6) Rumex fueginus, (7) Sonchus asper. 45 38 (1)Imágenes contrastantes de las dos variantes de la especie Dudleya brittoni. (1) Dudleya brittoni (Morfo blanco), (2) Dudleya brittoni (Morfo verde/glabro). ……………. 46