UNIVERSITE JOSEPH FOURIER - GRENOBLE I ECOLE DOCTORALE CHIMIE ET SCIENCES DU VIVANT Doctorat en Biologie Structurale et Nanobiologie Carmen GALIÁN BARRUECO Caractérisation de 2 transporteurs ABC (“ATP-Binding Cassette”) bactériens de fonction inconnue : YheI/YheH de Bacillus subtilis et Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis Thèse dirigée par le Dr. Jean-Michel JAULT Soutenue le 19 décembre 2008 à Grenoble Composition du Jury Dr. Daniel BRETHES Rapporteur Dr. Elie DASSA Rapporteur Prof. Eva PEBAY-PEYROULA Examinateur Dr. Daniel LEVY Examinateur Dr. Jean-Michel JAULT Directeur de thèse Thèse réalisée à l’Institut de Biologie Structurale J.-P. Ebel (UMR 5075 UJF/CNRS/CEA) et au Laboratoire de Biophysique Moléculaire et Cellulaire (ancienne UMR 5090 UJF/CNRS/CEA) MERCI à Jean-Michel, de son excellent encadrement, son enthousiasme scientifique, sa capacité à interpréter positivement les résultats, sa disponibilité illimitée, ses grandes qualités humaines, sa bonne humeur, ses encouragements quotidiens à Daniel et à Elie, d’avoir accepté de juger ce travail de thèse à Eva, de bien vouloir présider le jury et examiner ce travail à Daniel, d’intégrer le jury et d’examiner ce travail au Ministère Français de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche, à l’Université Joseph Fourier, à l’ANR, au GFB et à la FEMS, du soutien financier à Cristina, por haberme iniciado al proyecto YéYé y haber compartido conmigo todo su saber, por sus cualidades humanas y su amistad, por tantos viernes a las 20h esperando que el lunes hubiera mejores resultados à Anne ΔE, de m’avoir appris tellement sur les protéines membranaires et sur la façon de « rechercher », d’avoir partagé quotidiennement nos doutes, nos espoirs et nos sourires à Anne-E, de son amitié, de sa force, de son soin quotidien aux JMJ’s à Catherine, de sa sympathie, de son respect, de son optimisme à Johanna, de son sourire, de son énergie, de ses encouragements à Sandrine, d’avoir nuancé le mythe des boucles d’oreille et des colliers assortis à Saïda, à Marilia, à Ivan, à Cigdem, de m’avoir supportée en tant qu’encadrant à Matthieu, à Emilie et à Hien-Anh, de renouveler le sang des JMJ’s aux anciens thésards de Jean-Michel, de leur travail sur BmrA qui a fortement inspiré et simplifié ce travail à Iulia, ma fidèle compagne de bureau, de son amitié, de sa sensibilité, du partage quotidien à Richard, de sa sensibilité, de sa disponibilité sans faille à Jean, de ses questions illimitées, de sa naïveté consciente à Tof, de partager avec moi son enthousiasme pédagogique et ses réflexions toujours intéressantes à Julien, de son sourire qui nous manque à Isabelle et à Céline, de leur aide au quotidien avec un sourire comme devise à tous les membres du LPM et de l’ancien BMC, de l’opportunité de réaliser ce travail dans les meilleures conditions matérielles et humaines à Eva, de nous avoir accueillis à bras ouverts au sein du LPM à Daniel, des longues discussions scientifiques pleines d’humour qui m’ont tellement appris, de la motivation pour améliorer les purifications, de partager avec moi tes questions et de ta patience face aux miennes à Aurélie, de ton investissement dans le projet des YéYé, de tes précisions précieuses à Manuela, de renouveler le dynamisme des ABCs à Paris à l’équipe lyonnaise, Pierre, Fred, Rima, Attilio, Hélène, Sira, des discussions et bons moments à nos collaborateurs Virginie, Christoph et James, de leur aide et contributions à Claudine et à Laurence, de leur exemple de gestion et de motivation pleines de couleurs et à toute l’équipe colorée, du magnifique travail accompli et du plaisir d’en faire partie aux constructivistes, du questionnement soulevé sur les façons d’enseigner, des discussions révélatrices, de relancer l’utopie pédagogique et didactique à Aurore, de tant de dîners, de discussions, de passion artistique-littéraire, de gaufres partagés à Magali et à Walter, mes premiers amphitryons à Grenoble, de votre sympathie et tous ces moments passés ensemble à Guillaume, de son amitié et des soirées « Vin et France Culture » a los grasapardos (¿ podrán perdonar esta dolorosa generalizacion ?), a María, a Liva, a Marco, por la amistad incondicional a pesar del descuido por mi parte a mis padres, Ramón y Lupe, sin los cuales este documento no habría podido nacer, por su educación, por tanto amor y tanta esperanza puesta en mí a los CGCG, por sus ánimos, su empatía, su alegría, por ser mucho más que dos a los Atienza Badel, por su acogida, su respeto, su cariño a Ricardo, sustento y motivación cotidianos, por el placer de compartir también la tesis doctoral Résumé de la Thèse L'émergence du phénotype MDR (« multidrug resistance ») des cellules cancéreuses est souvent corrélée à la surexpression de protéines membranaires appartenant à la superfamille ABC (« ATP- binding cassette »). Ces protéines couplent l'hydrolyse de l'ATP au transport d'agents chimiothérapeutiques vers l'extérieur des cellules. Chez les bactéries, des transporteurs homologues ont été impliqués dans certains cas de résistance aux antibiotiques. Deux nouveaux transporteurs ABC bactériens, Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis et YheI/YheH de Bacillus subtilis, potentiellement impliqués dans la résistance aux antibiotiques, ont été étudiés ici en réalisant une expression hétérologue chez Escherichia coli et en isolant des vésicules de membrane inversées. Ce système s'est avéré inapproprié pour l'étude du transporteur Rv1747, à cause vraisemblablement des différences entre E. coli et M. tuberculosis dans l'usage des codons. En revanche, nous avons obtenu un niveau important de surexpression de YheI/YheH qui nous a permis de caractériser son activité de transport et d'hydrolyse de l'ATP. Nous avons ainsi montré que les deux protéines, YheI et YheH, s'associent pour former un exportateur hétérodimérique capable de transporter de multiples drogues, et que le rôle des deux sous-unités n'est pas identique dans le mécanisme catalytique du transporteur. Enfin, nous avons réussi à purifier le transporteur YheI/YheH avec un rendement élevé et dans un état fonctionnel stable, permettant d'approfondir sa caractérisation biochimique ainsi que d'obtenir des cristaux bidimensionnels pour une étude structurale par microscopie électronique. Mots clés : transporteurs ABC, protéines membranaires, résistance à de multiples drogues, résistance aux antibiotiques, détergents, protéoliposomes, mécanisme catalytique, hydrolyse de l'ATP Titre de la Thèse en anglais Characterization of 2 bacterial ABC ("ATP-Binding Cassette") transporters of unknown function : YheI/YheH from Bacillus subtilis and Rv1747 from Mycobacterium tuberculosis Résumé de la Thèse en anglais The multidrug resistance (MDR) phenotype of cancer cells is often associated with overexpression of membrane proteins which belong to the large superfamily of ABC ("ATP-binding cassette") transporters. These proteins couple ATP hydrolysis to the efflux of chemotherapeutic drugs. Homologous transporters from bacteria have been involved in antibiotic resistance. Two new bacterial ABC transporters, Rv1747 from Mycobacterium tuberculosis and YheI/YheH from Bacillus subtilis, putatively involved in antibiotic resistance, have been studied here after heterologous expression in Escherichia coli and isolation of inverted membrane vesicles. This system has proved not to be useful for the study of Rv1747, due probably to codon usage differences between E. coli and M. tuberculosis. By contrast, we reached a high expression level of YheI/YheH which allowed the characterization of its transport and ATP hydrolysis activities. We thus showed that these two proteins associate to form a heterodimeric transporter able to efflux several structurally unrelated drugs, and that the two subunits play different roles in the catalytic mechanism. Finally, we managed to purify YheI/YheH in high yield, in a functional and stable state, which allowed us to extend its biochemical characterization and to obtain 2D crystals for structural studies by electron microscopy. Mots clés en anglais : ABC transporters, membrane proteins, multidrug resistance, antibiotic resistance, detergents, proteoliposomes, catalytic mechanism, ATP hydrolysis Rv1747 et YheI/YheH: deux transporteurs ABC bactériens de fonction inconnue 5 6 Carmen GALIAN BARRUECO TABLE DES MATIERES Résumé et mots clés.........................................................................................................................5 Table des matières............................................................................................................................7 Liste des figures.............................................................................................................................11 Liste des tableaux..........................................................................................................................13 Abréviations....................................................................................................................................14 INTRODUCTION..............................................................................................................................17 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES...................................................................................................21 Les transporteurs ABC (« ATP-Binding Cassette »)...........................................................23 La diversité des transporteurs ABC......................................................................................23 Les domaines nucléotidiques................................................................................................25 Les domaines transmembranaires : leçons des structures 3D.............................................28 Questions ouvertes sur le mécanisme fonctionnel des transporteurs ABC..........................31 Couplage entre cycle hydrolytique et cycle de transport...................................................31 La phosphorylation des transporteurs ABC......................................................................34 Mécanisme catalytique d'hydrolyse...................................................................................34 La Résistance à de Multiples Drogues (MDR).....................................................................36 Le phénomène MDR et les transporteurs ABC humains......................................................36 La résistance à de multiples antibiotiques et les pompes à efflux bactériennes..................38 Transporteurs ABC MDR chez les procaryotes....................................................................41 Les mystères des transporteurs de multiples drogues.........................................................45 La reconnaissance de multiples drogues dévoilée ?........................................................46 D'autres rôles physiologiques pour les transporteurs de multiples drogues ?..................49 La bactérie Bacillus subtilis..................................................................................................51 La sporulation........................................................................................................................52 Les systèmes de transduction à deux composants..............................................................53 La réponse stringente...........................................................................................................55 Les transporteurs de drogues chez Bacillus subtilis.............................................................57 Les transporteurs ABC de drogues chez Bacillus subtilis....................................................58 Le transporteur YheI/YheH de B. subtilis.............................................................................61 YheI/YheH et le stress cellulaire...........................................................................................62 YheI/YheH et la sporulation..................................................................................................64 Rv1747 et YheI/YheH: deux transporteurs ABC bactériens de fonction inconnue 7 Table des matières La bactérie Mycobacterium tuberculosis.............................................................................65 La paroi cellulaire de M. tuberculosis....................................................................................67 Les sérine/thréonine protéine kinases chez M. tuberculosis................................................68 Les domaines FHA................................................................................................................70 Les transporteurs de drogues chez M. tuberculosis.............................................................73 Les transporteurs ABC de drogues chez M. tuberculosis.....................................................74 Le transporteur Rv1747 de M. tuberculosis.........................................................................76 La phosphorylation de Rv1747 par PknF..............................................................................78 Rôle physiologique de Rv1747 et PknF................................................................................79 MATERIELS ET METHODES..........................................................................................................81 Biologie Moléculaire...............................................................................................................83 Souches bactériennes.......................................................................................................83 Conditions de culture.........................................................................................................83 Techniques de Biologie Moléculaire.....................................................................................84 Préparation et transformation de bactéries compétentes.................................................84 Préparation d'ADN plasmidique........................................................................................84 Electrophorèse des fragments d'ADN...............................................................................85 Restriction et ligation..........................................................................................................86 Amplification d'ADN par PCR (polymerase chain reaction)..............................................86 Constructions........................................................................................................................87 Oligonucléotides................................................................................................................87 Plasmides utilisés..............................................................................................................88 Clonages et sous-clonages...............................................................................................88 Mutagenèse dirigée...........................................................................................................89 Délétion des gènes yheI et yheH......................................................................................91 Préparation de protéines recombinantes.............................................................................92 Surproduction analytique......................................................................................................92 Expression hétérologue chez Escherichia coli..................................................................92 Expression en système acellulaire....................................................................................93 Tests de solubilité et d'adressage à la membrane............................................................93 Surproduction préparative.....................................................................................................94 Préparation de vésicules de membrane inversées...........................................................94 Purification de YheI/YheH.................................................................................................95 Concentration des protéines.............................................................................................96 Dosage des protéines...........................................................................................................96 Méthode modifiée de Lowry..............................................................................................96 Dosage de Bradford..........................................................................................................97 Détection des protéines........................................................................................................98 8 Carmen GALIAN BARRUECO Table des matières Electrophorèse des protéines sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE)...........................98 Détection de protéines par immunorévélation...................................................................99 Chromatographie d'exclusion de taille................................................................................100 Reconstitution des protéines en liposomes........................................................................101 Méthodes d'étude fonctionnelle..........................................................................................104 Mesures d'activité ATPase..................................................................................................104 Préparation des solutions concentrées d'ATP et d'orthovanadate.................................104 Dosage de l'ADP produit par la réaction.........................................................................104 Dosage du phosphate inorganique produit par la réaction.............................................105 Mesures de transport de drogues.......................................................................................106 Transport de drogues dans des cellules.........................................................................107 Transport de drogues par des vésicules de membrane inversées.................................107 Mesures de sensibilité aux antibiotiques............................................................................109 Méthode de diffusion en milieu solide.............................................................................109 Méthode de dilution en milieu liquide..............................................................................109 RESULTATS ET DISCUSSION.....................................................................................................111 L'expression recombinante de Rv1747..............................................................................113 L'hypothèse de la dégradation protéolytique......................................................................114 L'hypothèse de l'arrêt traductionnel....................................................................................118 Etude de Rv1747 dans des vésicules membranaires.......................................................121 YheI/YheH : un transporteur ABC hétérodimérique..........................................................125 Le chevauchement génique................................................................................................125 Expression hétérologue de YheI et YheH chez E. coli.......................................................128 YheI et YheH forment « une ATPase » hétérodimérique...................................................129 YheI et YheH interagissent physiquement..........................................................................130 YheI/YheH : un transporteur ABC de multiples drogues..................................................132 Mesures de transport dans des vésicules de membrane inversées (IMVs).......................132 Mesures de transport dans des cellules.............................................................................135 Quelle fonction physiologique pour YheI/YheH ?.............................................................137 YheI/YheH et les antibiotiques............................................................................................137 L'atténuation transcriptionnelle : implication des antibiotiques ?........................................142 YheI/YheH et le stress cellulaire.........................................................................................146 YheI/YheH et la sporulation................................................................................................148 Purification de l'hétérodimère YheI/YheH..........................................................................150 Le choix du détergent..........................................................................................................151 Activité, homogénéité et stabilité de YheI/YheH purifié......................................................154 Rv1747 et YheI/YheH: deux transporteurs ABC bactériens de fonction inconnue 9 Table des matières Analyse par chromatographie d'exclusion de taille.........................................................155 Etude de l'activité ATPase...............................................................................................156 Analyse par ultracentrifugation analytique......................................................................157 Cristallisation de YheI/YheH...............................................................................................159 Purification séparée des sous-unités YheI et YheH...........................................................161 Reconstitution du transporteur YheI/YheH........................................................................163 Le choix des lipides.............................................................................................................163 Le choix du détergent..........................................................................................................165 Rapport lipide:protéine, détergent:lipide et orientation des protéines................................167 Activité ATPase de YheI/YheH reconstitué.........................................................................169 Bilan des différentes mesures.........................................................................................169 Constantes cinétiques de l'hydrolyse de l'ATP par YheI/YheH.......................................170 Etude des mutants catalytiques de YheI/YheH.................................................................172 Mutagenèse de la lysine conservée du motif A de Walker.................................................173 Mutagenèse de l'histidine conservée de l'H-loop................................................................176 Mutagenèse du carboxylate « catalytique »........................................................................178 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES..........................................................................................181 ANNEXES......................................................................................................................................185 Annexe A : Différentes familles d'antibiotiques................................................................187 Annexe B : Le traitement de la tuberculose.......................................................................193 Annexe C : Antiseptiques et cations quaternaires...........................................................195 Annexe D : Colorants fluorescents.....................................................................................196 Liste des structures chimiques détaillées dans les Annexes A-D..................................197 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.........................................................................................199 Communications et Publications................................................................................................231 10 Carmen GALIAN BARRUECO