Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas Programa de Pós-Graduação em Toxicologia e Análises Toxicológicas Barcode e bioprospecção de metabólitos das algas marinhas Laurencia aldingensis, L. dendroidea e Laurenciella sp. (Ceramiales, Rhodophyta) Erika Mattos Stein Tese apresentada junto ao Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, na área de concentração Toxicologia e Análises toxicológicas, para obtenção do título de DOUTOR. Orientador: Prof. Dr. Pio Colepicolo SÃO PAULO 2015 Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas Programa de Pós-Graduação em Toxicologia e Análises Toxicológicas Barcode e bioprospecção de metabólitos das algas marinhas Laurencia aldingensis, L. dendroidea e Laurenciella sp. (Ceramiales, Rhodophyta) Erika Mattos Stein Versão corrigida da Tese conforme resolução CoPGr 6018. O original encontra-se disponível no Serviço de Pós Graduação da FCF/USP. Tese apresentada junto ao Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, na área de concentração Toxicologia e Análises toxicológicas, para obtenção do título de DOUTOR. Orientador: Prof. Dr. Pio Colepicolo SÃO PAULO 2015 Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Biblioteca e Documentação do Conjunto das Químicas da USP. Stein, Erika Mattos S819b Barcode e bioprospecção de metabólitos das algas marinhas Laurencia aldingensis, L. dendroidea e Laurenciella sp. (Ceramiales, Rhodophyta) / Erika Mattos Stein. -- São Paulo, 2015. 317p. Tese (doutorado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas. Orientador: Colepicolo, Pio 1. Toxicologia 2. Produtos naturais 3. Rhodophyta I. T. II. Colepicolo, Pio, orientador. 615.9 CDD Erika Mattos Stein Barcode e bioprospecção de metabólitos das algas marinhas Laurencia aldingensis, L. dendroidea e Laurenciella sp. (Ceramiales, Rhodophyta) Comissão julgadora da Tese para obtenção do título de Doutor Prof. Dr. Pio Colepicolo Orientador/Presidente ________________________________ 1° Examinador ________________________________ 2° Examinador ________________________________ 3° Examinador ________________________________ 4° Examinador São Paulo, 15 de Dezembro de 2015 Aos meus pais, que sempre estiveram ao meu lado apoiando as minhas escolhas e acreditando nos meus sonhos. “Andei... Por caminhos difíceis, eu sei. Mas olhando o chão sob meus pés, vejo a vida correr. E assim a cada passo que der Tentarei fazer o melhor que puder. Aprendi... Não tanto quanto quis, mas vi que conhecendo O universo ao meu redor aprendo a me conhecer melhor; Assim escutarei o tempo que me ensinará A tomar a decisão certa a cada momento. E partirei... Em busca de muitos ideais, Mas sei que hoje se encontram meu passado, presente e futuro. Hoje sinto em mim a emoção da despedida. Hoje é o ponto de chegada. Mas, ao mesmo tempo, tempo de partida”. (Autor desconhecido) AGRADECIMENTOS À Deus por ter me dado coragem, força e perseverança. Aos meus pais por terem me apoiado e acreditado. Ao meu Orientador Dr. Pio Colepicolo pela confiança e por todos estes anos de trabalho juntos. Ao Dr. Anthony D. Wright pela oportunidade que me deu ao abrir as portas do seu laboratório para me receber. O estágio realizado na UH-Hilo sob sua supervisão, foi o diferencial deste trabalho. Simplesmente aprendi com o autor das minhas referências! À Dra. Mutue Toyota Fujii por ser este exemplo de pesquisadora, por ter me supervisionado na etapa de biologia molecular. Aos amigos do LabPio atualmente presentes ou que já seguiram seu caminho, Aline, Cíntia, Cícero, Daniel, Eliezer, Tati, Léo, Luiza, Natália, Ed, Sandra, pela amizade e companheirismo. Aos amigos da Seção de Ficologia-IBot que me aturaram durante todo o experimento de Barcode, Luanda, Bia, Pati, Alan. À Pesquisadora Dra. Luciana Retz de Carvalho do IBot que me conduziu os primeiros passos no mundo da fitoquímica, por ter feito de mim uma companheira de trabalho, por toda ajuda com as minhas moléculas, meus textos descritivos e, simplesmente, pelo seu exemplo de dedicação e entusiasmo pela ciência. À Prof. Dra. Valéria Cassano do IB-USP por ter disponibilizado seu tempo para me ensinar e sanar minhas dúvidas, e suas sequências que muito me ajudaram como referência para as minhas. À Dra. Lydia Fumiko Yamaguchi que me ajudou e muito me ensinou com os espectros de RMN. Ao Dr. Vaeudo Oliveira pela ajuda com os espectros de Infravermelho, pelo companheirismo e por nos trazer sempre alegria dentro de casa. Ao meu namorado Walace Nunes que me aturou nesse fim de doutorado e abraçou a causa junto comigo. Afinal, não basta ser, tem que participar! À querida Tia Bete Stein que sempre disponibilizou sua casa em Nova Guarapari, sem a qual as coletas tão teriam sido viáveis. A todos os amigos que fiz em Hilo que fizeram meus oito meses ficarem ainda mais especiais! À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa concedida, sem a qual a permanência para o desenvolvimento do trabalho não teria sido viável. RESUMO STEIN, E. M. Barcode e bioprospecção de metabólitos das algas marinhas Laurencia aldingensis, L. dendroidea e Laurenciella sp. (Ceramiales, Rhodophyta). 2015. 317f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015. A natureza e diversidade das estruturas químicas com atividade farmacológica que se tem encontrado nos organismos marinhos justificam a busca por novos compostos que são de interesse nas mais diversas áreas de aplicação. As espécies de macroalgas vermelhas, em especial Laurencia spp., merecem destaque pela enorme variedade de terpenos e acetogeninas que produzem, sendo consideradas de grande potencial na produção de novos fármacos. O estudo de seus constituintes pode fornecer importantes subsídios para a quimiotaxonomia, ecologia química, caracterização das espécies e avaliação do potencial biotecnológico. Baseado nisso, Laurencia aldingensis, L. dendroidea e Laurenciella sp. foram selecionadas para o presente estudo para isolamento, caracterização e teste de atividades biológicas dos seus compostos. A técnica do DNA barcoding foi utilizada como ferramenta de diagnóstico para garantir a similaridade entre as amostras de cada espécie, que foram coletadas em época e locais diferentes. Do extrato orgânico de Laurencia aldingensis, nove substâncias foram isoladas, sendo quatro esfingosinas (1-4), três terpenos (5-7) e duas novas substâncias halogenadas (8 e 9). Do extrato orgânico de Laurencia dendroidea formam isolados dois terpenos halogenados conhecidos (10, 11) e, do extrato de Laurenciella sp. três novas substâncias halogenadas alifáticas insaturadas (12-14), assim como um ácido graxo (15) e um esterol (16) conhecidos. Dentre elas, a 8 apresentou atividade citotóxica, mas não se mostrou seletivo, e as substâncias 4 e 11 apresentaram atividade esquistossomicida, bastante promissora. No entanto, nenhum deles apresentou atividade antioxidante. Diante desta investigação, podemos dizer que as informações geradas com os estudos de Laurencia aldingensis, L. dendroidea e Laurenciella sp. expandiram significantemente o conhecimento no que tange a diversidade química no gênero e o potencial biológico-farmacêutico dos mesmos. Palavras-chaves: esfingosinas, terpenos, substâncias halogenadas, antiesquistossomose, antioxidante, atividade citotóxica ABSTRACT STEIN, E. M. Barcode and bioprospecting of metabolites from the marine algae Laurencia aldingensis, L. dendroidea e Laurenciella sp. (Ceramiales, Rhodophyta). 2015. 317p. Thesis (PhD) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015. The nature and diversity of chemical structures with pharmacological activity that have been found in marine organisms justifies the search for new compounds that may have applications in various areas of interest. Species of red seaweeds, especially Laurencia spp., are special because of the unprecedented variety of terpenes and acetogenins they produce that are considered potentially useful for the production of new drugs. Study of their constituents can also provide important insights relating to their chemotaxonomy, chemical ecology, characterization of species and biotechnological potential. On this basis Laurencia aldingensis, L. dendroidea and Laurenciella sp., were selected for study and isolation, characterization, and biological activity assessment of isolatable quantities of their compounds. The technique of DNA barcoding was used as a diagnostic tool to ensure similarity between samples of each species collected at different times and places. From the organic extract of Laurencia aldingensis nine compounds were isolated; four sphingosines (1-4), three terpenes (5-7) and other two new halogenated compound (8, 9). From the organic extract of Laurencia dendroidea two known halogenated terpenes (10, 11) were isolated while from a similar extract of Laurenciella sp., three new halogenated aliphatic compounds (12-14) were isolated together with known fatty acid (15) and sterol (16). Among all isolates, 8 demonstrated unspecific cytotoxic activity and compounds 4 and 11 showed promising schistosomicidal activity. In applied antioxidant assays none of the isolates we noted to have activity. From the overall investigation it is also clear that the information gleaned from the studies of Laurencia aldingensis, L. dendroidea and Laurenciella sp., significantly expanded our knowledge base concerning chemical diversity in the genus Laurencia and their biological-pharmaceutical potential. Keywords: sphingosines, terpenes, halogenated compounds, anti schistosomiasis, antioxidant, cytotoxic activity ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Moléculas isoladas da espécie Laurencia dendroidea. .................................. 26 Figura 2. Substâncias isoladas de Laurencia catarinensis que apresentaram atividade citotóxica frente a linhagens tumorais. ................................................................ 27 Figura 3. Bromo-alenos C não terpenóides, marilzabicicloalenos A e B isolados de 15 Laurenciella marilzae. ......................................................................................... 27 Figura 4. Acetogeninas isoladas de Laurenciella marilzae. ......................................... 28 Figura 5. Acetogeninas C cíclicas isoladas do extrato aquoso da espécie Laurencia sp. 15 ............................................................................................................................. 29 Figura 6. Substâncias C15 halogenados isolados de Laurencia venusta. ....................... 29 Figura 7. Exemplar da amostra da espécie Laurencia aldingensis coletada no litoral do Espírito Santo. Apecto geral do talo (A). Detalhe do ramo (B). Vista superficial das células corticais com presença de dois "corps in cerise" por célula (C). Corte transversal do talo mostrando córtex e medula (D). ............................................ 32 Figura 8. Estrutura das aldingeninas A-D extraídas de L. aldingensis ......................... 33 Figura 9. Exemplar da amostra da espécie Laurencia dentroidea no habitat natural na Praia dos Castelhanos, litoral do Espírito Santo (A). Aspecto geral do talo (B). Detalhe do ramo (C). ........................................................................................... 34 Figura 10. Exemplar da amostra da espécie Laurenciella sp. no habitat natural na Praia de Meaípe, litoral sul do Espírito Santo (A). Detalhe do talo (B). Detalhe do ramo (C). Vista superficial das células corticais apresentando um "corp in cerise" por célula. ................................................................................................................... 35 Figura 11. Localização do estado do Espírito Santo no Brasil e suas coordenadas geográficas, com destaque para os municípios onde foram realizadas as coletas (Guarapari e Anchieta) e a capital Vitória como referência geográfica. ............. 37 Figura 12. Detalhe de um dos locais de coleta em Guarapari, Espírito Santo. ............. 37 Figura 13. Esquema representativo das subunidades rbcL e rbcS da Rubisco e a indicação dos principais primers usados dos estudos das espécies do complexo Laurencia. ............................................................................................................ 45 Figura 14. Árvore consenso enraizada de Neighbor-joining (NJ) inferida para sequências do UPA de espécimes do complexo Laurencia. Chondria dangeardii foi utilizada como grupo externo. Os valores de bootstrap (2.000 réplicas) referentes às análises de Neighbor-joining (NJ) e de Máxima Parcimônia (MP) e