UNIVERSIDAD DE LA REPÚBLICA FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE DESARROLLO DE LAS CIENCIAS BÁSICAS Trabajo final para la obtención del titulo de Magíster en Ciencias Biológicas: ESTROGENICIDAD EN LA CUENCA DEL RÍO SANTA LUCÍA Autora: Lic. Luciana Griffero Ramilo Director: Javier García-Alonso Co-Director: Franco Teixeira de Mello 1 Estrogenicidad en la cuenca del Río Santa Lucía Autora: Luciana Griffero Ramilo ([email protected]) Director: Javier García-Alonso ([email protected]) Co-Director: Franco Teixeira de Mello ([email protected]) 2 RESUMEN La intensificación en los últimos decenios de las actividades antrópicas ha provocado la liberación de cientos de contaminantes que se han dispersado en el ambiente. Particularmente, existe un gran interés científico en un grupo heterogéneo de sustancias químicas denominadas perturbadores endócrinos (PEs) que, mediante la alteración de las señales químicas internas en los organismos, comprometen la capacidad reproductiva y el desarrollo sexual en numerosas especies. Algunas de ellas pueden actuar imitando las señales estrogénicas, a este conjunto de compuestos se les conoce como xenoestrógenos. Abarcan sustancias con diferentes estructuras, incluyendo hormonas sintéticas y naturales, sustancias naturales y una gran cantidad de sustancias sintéticas como pesticidas, plastificantes y metales pesados. El objetivo general de este trabajo fue determinar la actividad estrogénica en sedimentos de la cuenca del Río Santa Lucía mediante el ensayo in vitro YES y analizar su variación a lo largo de la misma. Los principales resultados en este estudio fueron que, se halló estrogenicidad en 13 de los 42 sitios analizados. La cuenca con mayor presencia de estrogenicidad fue la del Colorado con un 55% de los sitios estrogénicos. Si bien la mayoría se asocian a zonas de alta urbanización, y agricultura como ocurre en la cuenca del Colorado, también se encontró estrogenicidad en sitios asociados con otros usos del suelo como la ganadería intensiva. En función de los resultados obtenidos se sugiere incluir como herramienta de monitoreo el usos de este tipo de bioensayos dado a que otorgan medidas rápidas y redituables de una variable como la estrogenicidad que si bien no se incluye dentro de los parámetros establecidos como estándares de calidad de agua, los xenoestrógenos poseen efectos nocivos tanto para la biota asociada a sistemas acuáticos como para la calidad del agua que se consume. ABSTRACT The intensification of human activities in recent decades has resulted in the releasing of hundreds of pollutants into the environment. In particular, there is great concern on a heterogeneous group of chemicals called endocrine disruptor chemicals (EDCs) which, by altering the internal chemical signals in organisms, compromise among other functions the reproductive capacity and sexual development in many species. Some of them act by mimicking estrogenic signals, these compounds are known as xenoestrogens. They include substances with different structures, like natural and synthetic hormones, natural substances and a large number of synthetic compounds such as pesticides, plasticizers and heavy metals. The overall objective of this work was to determine the estrogenic activity in sediments of the Santa Lucia River Basin using the in vitro YES assay analysing its variation along the basin. Estrogenicity was found in 13 of the 42 sites analysed. The Colorado creek showed the greater presence of estrogenicity. While most sites with estrogenicity are associated with highly urbanized and agriculture areas, (e.g. Colorado creek), estrogenicity also was found in different sites associated with other land uses such as intensive farming. This is the first time on characterize a basin by its estrogenicity in Uruguay, suggesting the employment of these kinds of bioassays as a tool for environmental monitoring. YES test provides quick and profitable measures of estrogenicity. 3 AGRADECIMIENTOS A mi director Javier García-Alonso y mi co-director Franco Teixeira de Mello quienes me han guiado, participado en los muestreos y sobre todo han hecho posible el desarrollo de este trabajo, gracias por su dedicación y aportes fundamentales a todo lo que he realizado. A Claudia Fosalba, quien me ha guiado con paciencia y dedicación y ha brindado todo su apoyo en los análisis químicos de laboratorio. A Daniele Bila quien me ha orientado, brindado todo su apoyo y recibido en el Laboratorio de Ingeniería Sanitaria de la Universidad Federal de Río de Janeiro donde fue posible capacitarme y realizar el ensayo fundamental desarrollado en este trabajo. A Giselle Gómez también de la UFRJ por toda su paciencia y compromiso, sin ella hubiese sido imposible analizar mis muestras y realizar el ensayo YES. Al Prof. Edwin Routledge de la Universidad de Brunel, UK por cedernos la levadura para realizar el ensayo a través de la Prof. Marcia Dezotti (UFRJ). A mi familia, sobre todo a mi madre Raquel Ramilo quien además de su apoyo incondicional me ha ayudado a resolver problemas con cálculos químicos y me ha aportado información relevante para la Tesis. Finalmente quiero agradecerles a los integrantes del tribunal quienes me hicieron grandes aportes al corregir la Tesis. 4 INDICE Introducción y antecedentes …………..……………………………………....7 Perturbadores endócrinos…………………….……………………………….......8 Estrógenos…………………………………………………………………………8 Efectos genómicos del receptor estrogénico………………………………………9 Efectos no genómicos del receptor estrogénico………………………………….10 Compuestos químicos con actividad estrogénica…….……………………..…...10 Detección de sustancias con actividad estrogénica………………………...…….12 Situación actual de la cuenca del Río Santa Lucía………………………..……...15 Objetivos e hipótesis………………………………………………………….....16 Metodología y área de estudio...........................................................................17 Área de estudio…………………………………………………….…………......17 Variables Físico-Químicas y usos del suelo…………….………………………..17 Ensayo YES……………………………………………….…...………………....20 Preparación de las muestras de sedimento………………….……………..…....20 Extracción de compuestos estrogénicos……………..…………………………...20 Preparación de Soluciones y medios de cultivo y análisis…..………...………22 Cultivo de la cepa………………………………..………………………………….23 Placas de análisis…………………………………………………..……………....24 Análisis de datos ensayo YES…………………………….……………………….25 Análisis de datos...…………………………………………………….…………..27 Formulación del modelo estadístico……………………………………………....27 Resultados……………………………………………………….………...…….30 Caracterización del uso del suelo...........................................................................30 Variables Físico-Químicas…………………………………….……….…............31 5 Caracterización de la cuenca según uso de suelos y variables Fisico-Químicas R = -0,63 …………………………………………………….…….32 P = 2,85e-04 Estrogenicidad……………………………………………………….……..........35 Citotoxicidad……………………………………….….......................................38 R = 0,58 Estrogenicidad y variables Fisico-Químicas……………………………………..39 R = -0,63 P = <0,0001 R = 0,07 Asociación entre la estrogenicidad y usos del suelo……………………………..37 P = 2,8e-04 P = 0,77 Discusión.……………………………………………………………….………..41 p Calidad de agua en la cuenca del Río Santa Lucía………………………............41 Actividad estrogénica en la cuenca del Río Santa Lucía………………………....44 Asociación entre parámetros fisico-químicos y estrogenicidad………………….48 ¿Cuáles son las posibles fuentes de xenoestrógenos en la cuenca de Santa Lucía? …………………………………………………………..50 Conclusiones……………………………………………………………………..52 Bibliografía………………………………………………………………………53 Anexo 1…...………………………………………………………………………60 6 INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES La intensificación en los últimos decenios de las actividades antrópicas reflejada por el incremento en el tamaño de la población humana, el desarrollo económico y tecnológico y el afán del consumo, ha provocado la liberación de cientos de contaminantes que se han dispersado en el ambiente. Estos compuestos pueden encontrarse en aguas superficiales y subterráneas, e incluso agua potable, pudiendo constituir un riesgo para la salud de los organismos vivos. Los sistemas fluviales se ven altamente afectados por este tipo de actividades ya que su hidrología, química y biología dependen además de la topología, geología, clima y vegetación (Allan & Johnson, 1997), de las actividades humanas que se realizan en la cuenca de drenaje (Karr & Schlosser, 1978). Muchas de estas actividades tienen un gran impacto sobre los ciclos biogeoquímicos, provocando grandes desequilibrios y una de sus principales consecuencias es el cambio en el uso del suelo (Vitousek, 1994; Pachauri et al., 2014). La calidad del agua de estos sistemas está determinada por procesos naturales, así como por las actividades humanas, ya sean las descargas directas o puntuales de vertidos urbano-industriales y domésticos, o la llegada de contaminantes por escorrentía desde tierras agrícolas (Schindler et al., 2008). Los sistemas fluviales son vistos como sistemas integrados longitudinalmente, existiendo una fuerte dependencia entre el funcionamiento del río aguas abajo y aquellos procesos que tienen lugar aguas arriba (Vannote et al., 1980). Es por ello, que es importante considerar las actividades o procesos que puedan estar ocurriendo aguas arriba (e.g. descarga de desechos puntal) para evaluar cuales pueden ser las consecuencias sobre la calidad de agua aguas abajo. Esto provoca que una inmensa cantidad de contaminantes de origen antropogénico se dispersen en el ambiente, particularmente la presencia de contaminantes químicos en el medio ha aumentado progresivamente en los últimos años (Becerril, 2009). Una de las grandes preocupaciones relacionadas a este tipo de sustancias es que pueden producir efectos adversos en los organismos expuestos a concentraciones muy bajas (ng L-1 a µg L -1) (Gaido et al., 1997). Dentro de estos compuestos, los perturbadores endócrinos afectan a todos los niveles de organización biológica cuando los organismos son expuestos crónicamente a concentraciones subletales, llegando incluso a generar extinciones locales (Kidd et al., 2007). 7 Perturbadores endócrinos (PEs) En particular, existe un gran interés científico en un grupo heterogéneo de sustancias que, mediante la alteración de las señales químicas internas en los organismos, comprometen el normal funcionamiento endócrino, incluyendo la capacidad reproductiva y el desarrollo sexual en numerosas especies (Norris & Carr, 2006). Estas sustancias son conocidas como perturbadores endócrinos (PEs), que se definen como: ¨Cualquier agente exógeno que interfiera con la síntesis, secreción, transporte, unión, acción o eliminación de una hormona natural responsables de la mantención, reproducción, desarrollo y/o comportamiento de los organismos¨ (EPA, 1997). Los efectos que pueden tener estos compuestos van desde perturbaciones o desviaciones transitorias y reversibles de la homeostasis, hasta la alteración irreversible en la diferenciación sexual y reproducción, efectos epigenéticos heredables e incluso extinciones locales de poblaciones expuestas a concentraciones subletales (Kidd et al., 2007; Vadja & Norris, 2010). En relación a los humanos, numerosos estudios demuestran la relación de PEs con el desarrollo y proliferación de cánceres (ver review Kabir et al., 2015). Muchos de estos químicos pueden actuar ya sea imitando la acción de hormonas naturales, bloqueándolas, alterando la secreción o el metabolismo de las mismas, modificando los niveles de receptores hormonales, o interfiriendo en otros sistemas de señalización que están directamente relacionados con el sistema endócrino como el sistema inmune o el nervioso (Porcher et al., 2009). Muchos de los PEs identificados hoy en día poseen actividad estrogénica o antiestrogénica es decir, actúan modificando la vía de acción de los estrógenos naturales ya sea uniéndose a sus receptores, alterando su patrón de síntesis o modificando sus receptores hormonales. Estrógenos Las hormonas esteroideas son lípidos derivados del colesterol, y son secretadas por las gónadas, la corteza adrenal y la placenta. Estas hormonas, controlan la determinación, diferenciación y desarrollo sexual, y pueden dividirse en estrógenos o andrógenos. En mamíferos, los principales estrógenos son la estrona, el estriol, y el 17β-estradiol (Singhal et al., 2009). Los estrógenos inducen etapas claves de la ovogénesis y cumplen una función vital en la fisiología reproductiva tanto femenina como masculina estimulando el crecimiento y diferenciación celular en tejido mamario, útero, vagina, ovario, testículos, epidídimo y próstata (Korach, 1994). Además tienen efectos sobre tejidos del sistema cardiovascular, óseo 8 y nervioso entre otros. Razón por la cual, niveles elevados de estrógenos se asocian con un menor riesgo de contraer enfermedades cardiovasculares, inicio de enfermedades renales tardío, además de ayudar a mantener la densidad ósea, y el desarrollo y funcionamiento del sistema nervioso (Barrett-Connor, 1997; Silbiger & Neugarten, 1955; Paganini-Hill & Henderson, 1994). La especificidad de la acción estrogénica depende de la presencia de receptores intracelulares y los estrógenos modulan la concentración de los mismos. Por ejemplo, el estradiol durante la fase folicular, induce la síntesis y el desarrollo de receptores aumentando su concentración (Malgor & Valsecia, 2000). El Receptor de Estrógeno (RE) es una proteína perteneciente a la superfamilia de receptores citoplasmáticos, fue identificado en 1962 por el grupo de Jensen, quienes describieron la presencia de sitios de unión del estrógeno en diferentes tejidos de ratas (Jensen & Jacobson, 1962). En 1996 fue descubierto un nuevo receptor que tenía gran homología con el ya conocido, razón por la cual se los denominó RE- α al primero y RE-β al segundo, los cuales poseen diferentes funciones dependiendo del tejido donde ejercen su acción. Esto determina que la fisiología de los estrógenos sea altamente compleja, sin contar que existen receptores localizados en la membrana, que median también funciones de estas hormonas lo que determina la existencia de dos vías principales de estrogenicidad: la genómica y la no genómica. Efectos genómicos del receptor estrogénico La teoría clásica de acción de las hormonas esteroideas establece que el receptor citoplasmático es activado al unirse al ligando, actuando como un factor transcripcional al unirse al ADN estimulando la transcripción de algunos genes. Inicialmente ocurre una homodimerización (α-RE/α-RE) o heterodimerización (α-RE/β-RE) del complejo hormona- receptor y se da el reconocimiento del elemento de respuesta a estrógeno (ERE). Después de esto se produce la transcripción al formarse el complejo de iniciación que incluye coactivadores, correpresores y proteínas reguladoras de la transcripción (Beato et al., 1996; Evans, 1988) (Figura 1.1). 9 Efectos no genómicos del receptor estrogénico Son procesos rápidos que ocurren en minutos o segundos y no requieren la transcripción y síntesis de proteínas para producir un efecto sino que son mediados por un receptor localizado en la membrana. Entre estos efectos rápidos se encuentran flujos de iones, desencadenamiento de potenciales de acción, descarga de vesículas secretoras o activación de proteínas kinasas asociadas a la membrana, todos ellos ocurren en unos pocos segundos o minutos (Kelly & Levin, 2001; Pietras et al., 2001) (Figura 1.1). Utilizando diferentes procedimientos se ha demostrado la presencia de receptores estrogénicos de membrana (REm) en distintos tejidos y líneas celulares (Pietras & Szego, 1977; 1979). Sin embargo, la mayor atención en los últimos 30 años ha sido dedicada a estudiar los efectos genómicos mediados por receptores citoplasmáticos, parte de esto se debe a que no se ha podido aislar hasta el momento y de esta manera caracterizar tanto estructural como funcionalmente, a los receptores de membrana que median los efectos rápidos debidos a hormonas esteroideas. Figura 1.1 Efectos genómicos vía receptor citoplasmático (izquierda) y no genómicos vía receptor de membrana (derecha) del receptor del estrógeno. Compuestos químicos con actividad estrogénica Los xenoestrógenos se caracterizan por generar respuestas agonistas similares a las señales estrogénicas; efecto que se ve favorecido por la relativamente baja especificidad de los 10